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抱恙在身范文第1篇

在《基礎(chǔ)教育課程改革綱要》中明確提出"要使學(xué)生具有初步的環(huán)境意識(shí)"，新課標(biāo)也強(qiáng)調(diào)，"增強(qiáng)對(duì)環(huán)境、資源的保護(hù)意識(shí)和法制意識(shí)，初步形成可持續(xù)發(fā)展的觀念，逐步養(yǎng)成關(guān)心和愛(ài)護(hù)環(huán)境的行為習(xí)慣。因此，在地理教學(xué)實(shí)踐中，應(yīng)逐步培養(yǎng)學(xué)生的環(huán)保意識(shí)。

1.充分挖掘現(xiàn)行教材中能夠進(jìn)行環(huán)保意識(shí)培養(yǎng)的內(nèi)容，通過(guò)課堂教學(xué)使學(xué)生獲取環(huán)保知識(shí)

要講清中學(xué)地理教材中有關(guān)自然資源的利用和保護(hù)的知識(shí)。初中地理教材中的世界氣候，自然景觀的地區(qū)差異，世界的自然資源和中國(guó)的氣候、河流、湖泊，中國(guó)自然資源的合理利用和保護(hù)，及中國(guó)的區(qū)域地理差異等知識(shí)。教師講授時(shí)，不僅要講清楚自然資源的概念，而且要詳細(xì)講解有關(guān)自然資源的利用和保護(hù)的知識(shí)。在講授黃河時(shí)，要說(shuō)明黃河及流域概況的知識(shí)，同時(shí)要指出，黃河所流經(jīng)的黃土高原在歷史上是一片"草豐林茂，沃野千里的綠洲"，但由于常年毀林開(kāi)荒，植被遭到嚴(yán)重破壞，造成大量的水土流失和生態(tài)失調(diào)，導(dǎo)致泥沙淤積下游，形成地上"懸河"，給廣大民眾帶來(lái)憂(yōu)患。同時(shí)還應(yīng)著重介紹，解放以來(lái)黃河兩岸的人民在黨的領(lǐng)導(dǎo)下，堅(jiān)持治理改造黃河，化害為利，趨利避害，使晉陜等沿河省區(qū)出現(xiàn)了田園似錦、棉麥豐收的喜人景象，生態(tài)面貌發(fā)生了巨大變化。這樣既體現(xiàn)了愛(ài)國(guó)主義教育，又進(jìn)行了具體生動(dòng)的環(huán)境教育，寓環(huán)境保護(hù)教育于地理課的教學(xué)之中。

新的課程標(biāo)準(zhǔn)把環(huán)保、人口、可持續(xù)發(fā)展等，作為高中地理教學(xué)的重點(diǎn)，高中地理教材把人類(lèi)對(duì)生活的地理環(huán)境、人類(lèi)活動(dòng)與地理環(huán)境的關(guān)系作為核心內(nèi)容，使學(xué)生樹(shù)立人與自然協(xié)調(diào)的可持續(xù)發(fā)展觀念，培養(yǎng)學(xué)生關(guān)注和保護(hù)環(huán)境的意識(shí)。因此，通過(guò)講解使學(xué)生認(rèn)識(shí)到自然資源不是取之不盡，用之不竭的，環(huán)境對(duì)廢棄物的容納能力是有限的，對(duì)資源的無(wú)節(jié)制掠奪開(kāi)采，對(duì)環(huán)境的任意污染與破壞，必然受到自然界的懲罰，通過(guò)破壞環(huán)境來(lái)侵犯他人的利益，危及子孫后代的生存，必將受到社會(huì)的譴責(zé)，從而明確人對(duì)自然的道德責(zé)任和義務(wù)，樹(shù)立"保護(hù)環(huán)境光榮，破壞環(huán)境可恥"的新型社會(huì)主義榮辱觀。

2.在課堂上，通過(guò)時(shí)事和歷史事件讓學(xué)生認(rèn)識(shí)到環(huán)境污染的危害性

科學(xué)技術(shù)突飛猛進(jìn)，人類(lèi)從自然界提取的資源越來(lái)越多，排放的廢棄物也與日俱增，資源消耗過(guò)大，生態(tài)破壞加劇，已使地球不堪重負(fù)，環(huán)境污染和生態(tài)破壞對(duì)人類(lèi)生存和發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，在地理課堂上通過(guò)時(shí)事和歷史事件問(wèn)題，適時(shí)的滲透在地理教學(xué)中，使學(xué)生進(jìn)一步了解環(huán)境污染對(duì)人類(lèi)生存的影響，窺視環(huán)境問(wèn)題的嚴(yán)重性。如： 2003年，在我國(guó)發(fā)生的非典疫情，它與生態(tài)環(huán)境的變化存在著內(nèi)在的、必然的聯(lián)系，環(huán)境的急劇惡化誘發(fā)水生物、野生動(dòng)物和致病微生物的突變，而濫捕濫殺、食用野生動(dòng)物的行為使致病微生物傳播到人體，進(jìn)而危害人類(lèi)的身體健康。在地理課上通過(guò)時(shí)事和歷史事件的滲透教學(xué)，使學(xué)生學(xué)到地理知識(shí)的同時(shí)，還接受到環(huán)境教育，通過(guò)對(duì)這些事件的了解研究，讓學(xué)生學(xué)會(huì)用地理學(xué)知識(shí)分析、評(píng)價(jià)這些事件的形成機(jī)制、演變過(guò)程與對(duì)策。

3.嘗試地理教育方式方法的改革，有效培養(yǎng)中學(xué)生的環(huán)保意識(shí)

3.1 通過(guò)設(shè)計(jì)爭(zhēng)議性問(wèn)題開(kāi)展討論，培養(yǎng)中學(xué)生的環(huán)保意識(shí)。世界上的事物是復(fù)雜的，許多事物的存在既對(duì)人類(lèi)的發(fā)展有益，也可能對(duì)人類(lèi)有潛在的危害?？茖W(xué)技術(shù)是把雙刃劍（如農(nóng)藥的使用、氟利昂利用的興衰、核能發(fā)電等），使學(xué)生認(rèn)識(shí)到這點(diǎn)是非常重要的。環(huán)境問(wèn)題的存在往往受多種因素的制約，在不同的地區(qū)，不同的時(shí)期有不同存在的形式；不同階層的人對(duì)同一環(huán)境問(wèn)題也會(huì)有不同的看法，因此，在地理教學(xué)中設(shè)計(jì)爭(zhēng)議性問(wèn)題，組織學(xué)生進(jìn)行多方面的討論，讓他們通過(guò)內(nèi)部矛盾的沖突，深入理解環(huán)境問(wèn)題，提高自身的環(huán)保意識(shí)。如在講高中地理 "新能源"一節(jié)時(shí)，設(shè)計(jì)"要不要發(fā)展核電"這一爭(zhēng)議性問(wèn)題，引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行思考，組織討論。核電站是全世界公眾關(guān)注的環(huán)境問(wèn)題焦點(diǎn)之一，有些學(xué)生認(rèn)為核能是一種清潔、廉價(jià)、能量密集、地區(qū)適應(yīng)性強(qiáng)、具有巨大發(fā)展前景的新能源，應(yīng)積極發(fā)展核電站；另外一些學(xué)生則認(rèn)為前蘇聯(lián)切爾諾貝利災(zāi)難性的核事故固然罕見(jiàn)，但人們不能忽視來(lái)自具有很高放射性的核廢料的威脅，應(yīng)削減或停止核電發(fā)展計(jì)劃。學(xué)生看問(wèn)題的角度不同，就會(huì)產(chǎn)生對(duì)核電不同的看法。通過(guò)激烈的爭(zhēng)論，其意義遠(yuǎn)不止是讓學(xué)生知道應(yīng)該不應(yīng)該發(fā)展核電站。

3.2 重視開(kāi)放性教學(xué)，加強(qiáng)環(huán)境教育，培養(yǎng)學(xué)生的多方面才能。所謂開(kāi)放性教學(xué)就是指環(huán)境教育中利用一些開(kāi)放性教學(xué)材料，這些材料不限于常用的課本，教師不給出固 定格式的結(jié)論，而是由教師指導(dǎo)學(xué)生通過(guò)搜集、閱讀文字資料，實(shí)地調(diào)查問(wèn)題現(xiàn)狀等學(xué)習(xí)活動(dòng)，使學(xué)生自己得出恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)論。

3.3 充分利用各種實(shí)踐活動(dòng)，將環(huán)境知識(shí)轉(zhuǎn)化為環(huán)保意識(shí)。環(huán)境意識(shí)的形成必須依賴(lài)于學(xué)生的實(shí)踐，而且只有在他們的實(shí)踐中才能表現(xiàn)出來(lái)。如果沒(méi)有接觸過(guò)協(xié)調(diào)環(huán)境關(guān)系有關(guān)的活動(dòng)，那么熱愛(ài)環(huán)境、保護(hù)環(huán)境只能是一句空話，所以，在地理教學(xué)中必須十分重視理論聯(lián)系實(shí)際，加強(qiáng)環(huán)境教育。

（1）把地理知識(shí)與周?chē)吹靡?jiàn)、摸得著的環(huán)境緊密聯(lián)系起來(lái)。如在學(xué)習(xí)選修五"自然災(zāi)害"這冊(cè)書(shū)中，要求學(xué)生根據(jù)自身的感受，了解我們身邊發(fā)生的自然災(zāi)害，特別是經(jīng)常影響本地的旱澇，寒潮等災(zāi)害性天氣，使學(xué)生們知道這些主要是由自然原因產(chǎn)生的環(huán)境問(wèn)題，人類(lèi)只有認(rèn)識(shí)自然規(guī)律，趨利避害，按客觀規(guī)律辦事，才能收到事半功倍的效果。

（2）結(jié)合參觀訪問(wèn)，增加感性知識(shí)，深化理性知識(shí)的學(xué)習(xí)。如在學(xué)習(xí)工業(yè)"三廢"的危害及治理的內(nèi)容后，帶領(lǐng)學(xué)生到中牟縣汽車(chē)產(chǎn)業(yè)園區(qū)考察，參觀工廠的污水處理設(shè)備，并聽(tīng)廠領(lǐng)導(dǎo)的介紹。同學(xué)們對(duì)工業(yè)"三廢 "的治理過(guò)程有了清晰的了解，不但獲得環(huán)保的技能知識(shí)，而且在親身的感受中潛移默化地提高了環(huán)保意識(shí)。

（3）結(jié)合春游，讓學(xué)生在大自然中體會(huì)環(huán)境保護(hù)的必要性。如去年我班到中牟縣雁鳴湖景區(qū)春游，我就緊緊抓住這個(gè)機(jī)會(huì)，引導(dǎo)學(xué)生在觀察中思考討論："雁鳴湖"景區(qū)旅游業(yè)的現(xiàn)狀、發(fā)展與環(huán)境保護(hù)的關(guān)系；建造雁鳴湖休閑度假村的實(shí)際意義，為什么政府要花這樣多的資金造這個(gè)龐然大物等等。

抱恙在身范文第2篇

環(huán)境污染、資源短缺、生態(tài)危機(jī)等已經(jīng)成為世界性難題。造成環(huán)境污染的因素有很多， 其中化學(xué)污染對(duì)環(huán)境、人類(lèi)健康和社會(huì)發(fā)展的危害越來(lái)越受到全社會(huì)的普遍關(guān)注。中學(xué)階段是一個(gè)人成長(zhǎng)和發(fā)展的關(guān)鍵時(shí)期，在中學(xué)化學(xué)教學(xué)中加強(qiáng)對(duì)學(xué)生環(huán)境保護(hù)意識(shí)的教育，對(duì)他們今后走向社會(huì)具有潛移默化的作用。因此在中學(xué)化學(xué)教學(xué)中滲透環(huán)保意識(shí)是每一個(gè)中學(xué)化學(xué)教師義不容辭的責(zé)任?；瘜W(xué)與環(huán)境密切相關(guān)，化學(xué)中的環(huán)境保護(hù)素材十分豐富，在化學(xué)教學(xué)中開(kāi)展環(huán)保教育，有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。那么，怎樣在化學(xué)教學(xué)中滲透環(huán)保教育呢?

一、在傳授化學(xué)知識(shí)的過(guò)程中滲透環(huán)保教育

把化學(xué)知識(shí)教學(xué)與環(huán)境保護(hù)教育有機(jī)結(jié)合起來(lái)，既能提高學(xué)生的環(huán)保意識(shí)，又能增強(qiáng)學(xué)生學(xué)習(xí)化學(xué)的興趣。例如，學(xué)習(xí)“空氣”時(shí)，讓學(xué)生了解本來(lái)空氣的成分是比較固定的，適合人類(lèi)和動(dòng)植物的生存，但近幾百年來(lái)，工業(yè)污染改變了空氣的組成，從而改變了我們的生態(tài)環(huán)境。在介紹煤時(shí)，讓學(xué)生了解煤的組成，煤燃燒時(shí)會(huì)釋放一氧化碳、二氧化碳、二氧化硫、二氧化氮等，其中一氧化碳是劇毒物質(zhì)，二氧化碳會(huì)引起溫室效應(yīng)，二氧化硫、二氧化氮會(huì)使雨水變酸。在講授水與氫時(shí)，讓學(xué)生在認(rèn)識(shí)水對(duì)于人類(lèi)生活、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要性和水資源的有限性的基礎(chǔ)上，知道工業(yè)廢水、生活污水的任意排放會(huì)造成水體污染、水質(zhì)惡化，以至給人類(lèi)造成災(zāi)難。學(xué)習(xí)水的凈化等知識(shí)時(shí)，向?qū)W生介紹硬水對(duì)人體健康、人們生活和工業(yè)生產(chǎn)的不利影響，使學(xué)生了解硬水軟化的方法和基本原理，學(xué)會(huì)處理硬水。在二氧化碳的教學(xué)中，讓學(xué)生了解二氧化碳循環(huán)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的作用，二氧化碳與溫室效應(yīng)的關(guān)系，一氧化碳對(duì)空氣的污染，煤氣中毒、吸煙危害健康與一氧化碳毒性的關(guān)系及一氧化碳中毒的預(yù)防。在介紹氮、磷、鉀等化肥時(shí)，既介紹化肥對(duì)提高農(nóng)作物產(chǎn)量的積極作用，又介紹其對(duì)農(nóng)產(chǎn)品、土壤、水體造成的污染?！?/p>

二、在化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中滲透環(huán)保教育

化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)是實(shí)施環(huán)境教育的重要途徑。在化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，教師可通過(guò)言傳身教，引導(dǎo)和增強(qiáng)學(xué)生的環(huán)保意識(shí)，使學(xué)生養(yǎng)成良好的環(huán)保習(xí)慣。

1、以環(huán)保意識(shí)備好實(shí)驗(yàn)課。備有關(guān)實(shí)驗(yàn)課時(shí)，要設(shè)計(jì)好對(duì)學(xué)生進(jìn)行環(huán)保教育的內(nèi)容，以及有關(guān)實(shí)驗(yàn)的教學(xué)內(nèi)容和方法，特別是在有毒氣體的實(shí)驗(yàn)中，要做好毒氣泄漏的預(yù)防、處理、吸收及停止實(shí)驗(yàn)的方法設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)中廢棄物的處理、回收與再利用的方法設(shè)計(jì)等。

2、以身作則，規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作。教師的行為是一種無(wú)聲的語(yǔ)言，因此教師以身作則、規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作對(duì)進(jìn)行環(huán)保教育有重要的意義。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，教師要言行一致，做到實(shí)驗(yàn)操作正確規(guī)范，尤其是涉及環(huán)境教育的實(shí)驗(yàn)。

3、改進(jìn)實(shí)驗(yàn)，體驗(yàn)環(huán)保。

在不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提下改進(jìn)實(shí)驗(yàn)，盡量減少實(shí)驗(yàn)中有毒或有害物質(zhì)對(duì)人的危害及對(duì)環(huán)境的污染，既是實(shí)驗(yàn)安全的要求，又有利于對(duì)學(xué)生進(jìn)行環(huán)境保護(hù)教育。例如，可燃物燃燒條件的探究實(shí)驗(yàn)，可將現(xiàn)有儀器改裝成能防毒氣逸出的實(shí)驗(yàn)裝置；又如，氨分子擴(kuò)散的探究實(shí)驗(yàn)，可以將氨水改為醋酸，將酚酞改為紫色石蕊試液。 轉(zhuǎn)貼于

4、開(kāi)展微型實(shí)驗(yàn)，減少環(huán)境污染。開(kāi)展微型實(shí)驗(yàn)是當(dāng)前國(guó)際上化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的趨勢(shì)。這種實(shí)驗(yàn)是用盡可能少的試劑來(lái)獲得比較明顯的反應(yīng)結(jié)果和準(zhǔn)確的化學(xué)信息，實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)物和產(chǎn)物的量都很少，產(chǎn)生的有害物質(zhì)對(duì)環(huán)境造成的污染可降到最低程度。如在金屬的化學(xué)性質(zhì)探究實(shí)驗(yàn)中，改在試管中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)為在點(diǎn)滴板上進(jìn)行。

三、在豐富多彩的課外活動(dòng)中開(kāi)展環(huán)保教育

結(jié)合化學(xué)教學(xué)的課外活動(dòng)既能培養(yǎng)學(xué)生理論聯(lián)系實(shí)際的能力，又能相機(jī)開(kāi)展環(huán)境教育。

1、組織學(xué)生參觀化工廠。結(jié)合課堂知識(shí)，帶學(xué)生去參觀附近的化工廠，可引導(dǎo)學(xué)生用所學(xué)的知識(shí)去分析車(chē)間的生產(chǎn)流程，并提醒學(xué)生注意工廠對(duì)廢水、廢渣、廢氣的處理。

2、舉辦環(huán)保科技知識(shí)專(zhuān)題講座。結(jié)合目前國(guó)內(nèi)外形勢(shì)和環(huán)境科學(xué)的熱點(diǎn)問(wèn)題，根據(jù)學(xué)生的知識(shí)基礎(chǔ)，可定期給學(xué)生舉辦環(huán)境保護(hù)知識(shí)專(zhuān)題講座，如“世界著名的公害事件”、“吸煙與健康”、“溫室效應(yīng)”、“酸雨的形成與危害”等，在開(kāi)闊學(xué)生視野的同時(shí)使學(xué)生受到良好的環(huán)境教育。

3、指導(dǎo)學(xué)生課外閱讀。利用課余時(shí)間，可指導(dǎo)學(xué)生閱讀與環(huán)境知識(shí)有關(guān)的報(bào)紙、雜志和科普讀物，搜集整理有關(guān)環(huán)境污染與保護(hù)的資料，并要求學(xué)生做讀書(shū)筆記。另外，還可利用學(xué)校的黑板報(bào)宣傳欄、廣播室、手抄報(bào)等多種媒體，大力宣傳環(huán)境知識(shí)，營(yíng)造環(huán)境教育的良好氛圍，使學(xué)生都參與到環(huán)?；顒?dòng)中來(lái)。

抱恙在身范文第3篇

2006年初，華晨寶馬在中國(guó)大陸的本地供應(yīng)商數(shù)量為46家，本地采購(gòu)額為8.7億元，到2006年底，本地采購(gòu)額已達(dá)20億元。目前，本地供應(yīng)商數(shù)量已經(jīng)發(fā)展到超過(guò)60家。預(yù)計(jì)到2007年底，本地供應(yīng)商數(shù)量將達(dá)到100家，本地采購(gòu)額將增長(zhǎng)80%，達(dá)到36億元。

華晨寶馬汽車(chē)有限公司總裁兼首席執(zhí)行官吳佩德先生表示：“穩(wěn)步推進(jìn)本地化采購(gòu)進(jìn)程是華晨寶馬的長(zhǎng)期戰(zhàn)略。這不僅僅是為了滿(mǎn)足政府對(duì)于國(guó)產(chǎn)化率的要求，同時(shí)也為了提升我們企業(yè)產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。中國(guó)是一個(gè)擁有巨大商機(jī)的市場(chǎng)，華晨寶馬將繼續(xù)遵循高檔品牌戰(zhàn)略，與供應(yīng)商保持和擴(kuò)大共贏的合作伙伴關(guān)系，在幫助中國(guó)的汽車(chē)零部件企業(yè)走向世界的同時(shí)，不斷提高企業(yè)的自身實(shí)力，努力成為中國(guó)高檔轎車(chē)市場(chǎng)上的領(lǐng)先企業(yè)?！?/p>

華晨寶馬的供應(yīng)商發(fā)展戰(zhàn)略建立在三個(gè)基石上：寶馬集團(tuán)的全球供應(yīng)商在中國(guó)的獨(dú)資企業(yè)、合資企業(yè)和中資企業(yè)。不管是現(xiàn)有和潛在的合作伙伴，寶馬汽車(chē)的供應(yīng)商必須完全滿(mǎn)足兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：寶馬全球統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和全面的競(jìng)爭(zhēng)力。寶馬集團(tuán)生產(chǎn)材料采購(gòu)高級(jí)副總裁Klaus Richter博士在向華晨寶馬的供應(yīng)商介紹寶馬集團(tuán)全球采購(gòu)體系時(shí)表示,凡是向華晨寶馬供貨的供應(yīng)商，都有機(jī)會(huì)進(jìn)入到寶馬集團(tuán)全球的采購(gòu)體系。因?yàn)閷汃R集團(tuán)的全球采購(gòu)系統(tǒng)是一個(gè)公開(kāi)透明的平臺(tái)。所有希望進(jìn)入這個(gè)系統(tǒng)的供應(yīng)商必須在產(chǎn)品質(zhì)量上達(dá)到寶馬全球統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，而且要有全面的競(jìng)爭(zhēng)力。例如，中國(guó)的戴卡輪轂制造有限公司馬上就成功地進(jìn)入寶馬全球采購(gòu)體系，為BMW 5系提供輪轂。

由于華晨寶馬采用的是寶馬集團(tuán)全球統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，所以，中國(guó)大陸的供應(yīng)商如滿(mǎn)足質(zhì)量和競(jìng)爭(zhēng)力兩方面的要求，都將能有機(jī)會(huì)進(jìn)入寶馬集團(tuán)全球采購(gòu)系統(tǒng)。

豐田任命第一位常駐中國(guó)本部長(zhǎng)

豐田汽車(chē)公司（以下簡(jiǎn)稱(chēng)豐田）于6月22日召開(kāi)2007年股東大會(huì)及董事會(huì)議，通過(guò)公司重要決議并對(duì)公司部分董事成員進(jìn)行改選任命。

抱恙在身范文第4篇

基金項(xiàng)目：全軍十二?五重點(diǎn)課題（BWS12J018）

作者單位：510010 廣州，南方醫(yī)科大學(xué)研究生院，廣州總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（劉云松）；南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所（鄧旭斌）；廣州總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（蘇磊）

通信作者：蘇磊， Email：

【摘要】目的 通過(guò)觀察熱打擊誘導(dǎo)活性氧（reactive oxygen species，ROS）爆發(fā)性增多對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響，探討重癥中暑所致腦損害的發(fā)病機(jī)理。方法 建立神經(jīng)元細(xì)胞熱打擊模型，對(duì)照組將細(xì)胞置于標(biāo)準(zhǔn)37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，熱打擊組將細(xì)胞置于43 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中熱打擊2 h，熱打擊后繼續(xù)37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育，DCFH法檢測(cè)熱打擊后0 h、0.5 h、1 h、2 h細(xì)胞內(nèi)ROS含量；Annexin V-FITC/PI雙染色方法和Westen blot檢測(cè)熱打擊后0 h、3 h、6 h、12 h細(xì)胞凋亡率及caspase-3蛋白表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)ROS特異性清除劑MnTMPyP對(duì)熱打擊后12 h細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 與對(duì)照組比較，43 ℃熱打擊后0 h細(xì)胞內(nèi)ROS增加，2 hROS呈爆發(fā)性增多（P

【關(guān)鍵詞】重癥中暑；腦損害；熱打擊；熱打擊模型；神經(jīng)元細(xì)胞；凋亡；凋亡機(jī)制；活性氧

The effect of reactive oxygen species on heat stress-induced neuronal apoptosis Liu Yunsong ， Deng Xubing， Su Lei.Department of Intensive Care Unit， General Hospital of Guangzhou Military Command， Key Laboratory of Tropical Zone Trauma Care and Tissue Repair of PLA， Guangzhou 510010， China

Corresponding author： Su Lei， Email：

【Abstract】Objective To observe the effect of heat stress-induced burst out of reactive oxygen on neuronal apoptosis and investigate pathogenesis of brain damage caused by severe heat stroke. Methods Neurons heat stress model is set up. Control group were incubated at 37 ℃，5%CO2，While heat stress group of cells were incubated at 43 ℃ for 2 h，then all the cells were further incubated at 37 ℃ for different time as indicated.The amounts of ROS were assayed by DCFH staining at 0 h， 0.5 h， 1 h， 2 h after heat stress. Apoptosis was analyzed by flow cytometry using Annexin V-FITC/PI staining and expression of caspase-3 were determined by westen blotat 0 h、3 h、6 h、12 h after heat stress. In addition， MnTMPyP is the specificscavengers of ROS，which effect on apoptosis is also studied at 12 h after heat stress.Results Compared with control group，amounts of ROS was significant increased at 0 h after heat stress，the burst out of it was at 2 h after heat stress（P

【Key words】Severe heat stroke； Brain damage；Heat stress；Heat stress model；Neuron；Apoptosis；Apoptosismechanism； Reactive oxygen species

重癥中暑是威脅健康的嚴(yán)重疾病，表現(xiàn)為中心體溫升高超過(guò)40 ℃以及各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙如譫妄、抽搐、昏迷等[1]。由高熱引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害是重癥中暑的主要特征之一，其損害程度也直接決定了重癥中暑的病情及預(yù)后[2]。目前，重癥中暑中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的病理生理機(jī)制尚不明確。凋亡在中暑發(fā)病中的作用已逐漸受到重視，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)高熱可誘導(dǎo)機(jī)體大量細(xì)胞凋亡[3-4]。到目前為止，關(guān)于中樞神經(jīng)細(xì)胞在中暑熱打擊中發(fā)生凋亡的研究較少，國(guó)外僅Vogel觀察到了熱打擊后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象[5]，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究觀察熱打擊后神經(jīng)元凋亡以及細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）爆發(fā)性增加與神經(jīng)元凋亡的相關(guān)性，探討ROS在重癥中暑中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害中的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器A200144

CO2孵箱（中國(guó)上海艾測(cè)電子科技有限公司）；倒置相差顯微鏡（德國(guó)Leica）、熒光顯微鏡（德國(guó)Leica）、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（ DMR） 圖像分析（德國(guó)Leica）；流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品；酶標(biāo)光度計(jì)為美國(guó)BIO-RAD產(chǎn)品；貝克曼GS-15R高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)）；ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Amersham公司。

1.2 SD大鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞株培養(yǎng)

SD大鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞購(gòu)于賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司，在南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)液由含600 mg/mL葡萄糖的DMEM加10%馬血清、終質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的轉(zhuǎn)鐵蛋白、5 μg/mL胰島素、20 nmol孕酮、100 μmol/L腐胺、30 nmol/L二氧化硒及

100 U/mL雙抗組成，將神經(jīng)元細(xì)胞置于37 ℃、體積5%CO2及飽和濕度條件的孵箱中培養(yǎng)。約2～3 d進(jìn)行1次傳代，傳代按1∶2至1∶3的比例進(jìn)行。細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 熱打擊及細(xì)胞存活率測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期神經(jīng)元細(xì)胞，按5×104/孔密度鋪入可拆卸96孔板，待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后進(jìn)行熱打擊處理。對(duì)照組將細(xì)胞置于標(biāo)準(zhǔn)37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱2 h，熱打擊組分別置于39 ℃、41 ℃、43 ℃及45 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中2 h，各組分別設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。熱打擊后繼續(xù)在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育12 h后加入CCK8（碧云天） 10 μL/孔，具體操作參考說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于450 mm處讀取OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)分別獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4 Annexin V /PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

熱打擊組為將細(xì)胞置于43 ℃ 2 h，對(duì)照組37 ℃ 2 h，熱打擊后分別繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育0、3、6、12 h。使用Annexin V/PI試劑盒（invitrogen），按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，調(diào)整待檢測(cè)細(xì)胞濃度為1×106/mL，冰PBS潤(rùn)洗兩次2次，將細(xì)胞重懸于100 μL含 2 ulAnnexin-V-FITC（20 μg/mL） 緩沖液中輕輕混勻，避光室溫放置15 min。轉(zhuǎn)至流式檢測(cè)管，加入400 μL PBS，每個(gè)樣品臨上機(jī)前加入1 μL PI（50 μg/mL），2 min后迅速檢測(cè)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)EX=488 nm；發(fā)射波長(zhǎng)Em=530 nm。

1.5 Westen blot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達(dá)

Westen blot參考文獻(xiàn)[6]說(shuō)明進(jìn)行。一抗使用caspase-3兔來(lái)源激活型抗體（1∶1000，碧云天），二抗使用結(jié)合有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體（1∶5000， 碧云天）。抗體孵育完成后使用化學(xué)發(fā)光劑ECL進(jìn)行反應(yīng)、曝光。

1.6 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)

使用DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS，按照說(shuō)明書(shū)操作，分別收集熱打擊組及對(duì)照組細(xì)胞，用終質(zhì)量濃度10 μmol/L的DCFH-DA分子探針（碧云天）懸浮收集后的細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整為107/mL，并將細(xì)胞置入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。熱打擊組將細(xì)胞置于43 ℃ 2 h，對(duì)照組37 ℃ 2 h，按照0、0.5、1、2 h時(shí)間點(diǎn)，使用激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em=525 nm檢測(cè)熒光的強(qiáng)弱。

1.7 ROS特異性清除劑MnTMPyP干預(yù)

MnSOD活性類(lèi)似物MnTMPyP（Calbiochem公司）為ROS特異性清除劑，對(duì)照組和熱打擊組神經(jīng)元細(xì)胞在進(jìn)行熱打擊處理前使用濃度為10 μmol/L的MnTMPyP預(yù)處理1 h，熱打擊2 h后繼續(xù)培養(yǎng)12 h，Annexin V/PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Westen blot 檢測(cè)caspase-3蛋白的表達(dá)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。計(jì)量資料在方差齊性的基礎(chǔ)上應(yīng)用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間差異用LSD法比較，以P

2 結(jié)果

2.1 熱打擊后神經(jīng)元細(xì)胞活力下降

39 ℃熱打擊對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞活力無(wú)影響，但隨著熱打擊溫度的增高（41～45 ℃），神經(jīng)元細(xì)胞的活力呈現(xiàn)進(jìn)行性下降，與對(duì)照組（37 ℃）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

與對(duì)照組比較，aP

圖1 不同溫度熱打擊神經(jīng)元細(xì)胞存活率

Fig 1 Cell viability of neurons at different temperature during heat stress

2.2 熱打擊后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡增加

與對(duì)照組37 ℃比較，43 ℃熱打擊細(xì)胞2 h后立即檢測(cè)（0 h）未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡增加，但在熱打擊3 h后細(xì)胞凋亡開(kāi)始明顯增加，細(xì)胞凋亡顯示出熱打擊后時(shí)間依賴(lài)性增加（熱打擊后12 h神經(jīng)元凋亡達(dá)43.2%）（圖2），與對(duì)照組（37 ℃）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

圖2 熱打擊后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率比較

Fig 2 Comparison ofapoptoticneuronal at different time during heat stress

2.3 熱打擊導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)爆發(fā)性ROS增加

Pucciariello等[7]研究已發(fā)現(xiàn)遭受熱打擊可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加。為了證實(shí)神經(jīng)元細(xì)胞遭受熱打擊后是否也會(huì)導(dǎo)致ROS水平的增加，本研究使用DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，發(fā)現(xiàn)遭受熱打擊后神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ROS水平爆發(fā)性增加，熱打擊后0 h即明顯增加，2 h增加了近8倍（與對(duì)照組37 ℃比較，P

圖3 熱打擊后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元細(xì)胞caspase-3蛋白比較

Fig 3 Comparison of caspase-3 inneurons at different time during heat stress

圖4 熱打擊后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)ROS比較

Fig 4 Comparison of ROS inneurons at different time during heat stress

2.4 ROS特異性清除劑MnTMPyP明顯抑制了熱打擊誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和caspase-3蛋白的表達(dá)

為了證實(shí)ROS在熱打擊誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡中的作用，研究使用了MnSOD活性類(lèi)似物MnTMPyP（Calbiochem公司），對(duì)照組和熱打擊組神經(jīng)元細(xì)胞在進(jìn)行熱打擊處理前使用濃度為10 μmol/L的MnTMPyP預(yù)處理1 h，熱打擊2 h后繼續(xù)培養(yǎng)12 h，檢測(cè)細(xì)胞凋亡和caspase-3蛋白的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)ROS清除劑MnTMPyP明顯抑制了熱打擊誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞從47.42%將至18.45%，MnTMPyP處理熱打擊組與熱打擊組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

A：MnTMPyP對(duì)不同溫度熱打擊神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率的影響；B：MnTMPyP對(duì)不同溫度熱打擊神經(jīng)元細(xì)胞caspase-3表達(dá)的影響

圖5 MnTMPyP對(duì)不同溫度熱打擊神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響

Fig 5 The effect of MnTMPyP in apoptotic neurons at different temperature during heat stress

3 討論

目前研究已證實(shí)，高溫和熱輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡在重癥中暑病理生理過(guò)程中起著非常重要的作用[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)43 ℃熱打擊后2 h神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ROS水平爆發(fā)性增加，43 ℃熱打擊后12 h可導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞大量凋亡，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS水平與熱打擊誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

細(xì)胞凋亡又稱(chēng)細(xì)胞程序性死亡，是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過(guò)程，這一過(guò)程廣泛存在于高級(jí)的哺乳動(dòng)物乃至人類(lèi)，由各種死亡信號(hào)包括低氧、氧化應(yīng)激、藥物等觸發(fā)[8-9]。細(xì)胞受各種凋亡信號(hào)刺激后通過(guò)一個(gè)復(fù)雜的多水平的調(diào)控，多種因素相互作用介導(dǎo)凋亡過(guò)程[9]。目前研究已發(fā)現(xiàn)，caspase 家族成員是細(xì)胞凋亡中核心的啟動(dòng)者和執(zhí)行者，信號(hào)傳遞到核內(nèi)切酶而執(zhí)行死亡功能。在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)14種同源分子caspase1-14，其中caspase-3是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者，通過(guò)特異性地裂解一套底物而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10]。一旦caspase3 活化，細(xì)胞凋亡不可避免[10-11]。本研究顯示43 ℃熱打擊后12 h，caspase-3活化程度與細(xì)胞凋亡趨勢(shì)一致，推測(cè)熱打擊誘導(dǎo)的凋亡是通過(guò)caspase途徑介導(dǎo)的。

ROS是需氧生物在氧氣代謝的過(guò)程中產(chǎn)生的一類(lèi)比氧氣的性質(zhì)更活潑的物質(zhì)[11]。許多促凋亡信號(hào)如環(huán)境不利因素、損傷、輻射等都可使細(xì)胞內(nèi)源性或外源性ROS升高或氧化還原平衡改變，這種改變既可能作為信號(hào)觸發(fā)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，也可能在凋亡啟動(dòng)后，加速凋亡過(guò)程[12]。近年來(lái)許多研究已證實(shí)熱打擊細(xì)胞可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平爆發(fā)性增加，并且認(rèn)為ROS直接介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生[13-15]。中暑動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，遭受熱打擊后的動(dòng)物腦內(nèi)ROS水平明顯升高[16]，但目前沒(méi)有直接的證據(jù)支持熱打擊后ROS的升高是否直接與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)使用MnTMPyP（ROS特異性清除劑）干預(yù)了熱打擊后神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ROS的水平后發(fā)現(xiàn)，MnTMPyP可明顯抑制43 ℃熱打擊后12h誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的活化以及凋亡的發(fā)生，提示熱打擊后神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ROS水平爆發(fā)性增加直接介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

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抱恙在身范文第5篇

【摘要】 【目的】 探討不同溫度和培養(yǎng)基在申克孢子絲菌酵母相轉(zhuǎn)化中的作用?！痉椒ā?將4株臨床分離菌株分別接種于SDA、PDA、BHI、50 mg/kg羊血BHI及5 mg/kg GSBHI 5種培養(yǎng)基平皿上，每種培養(yǎng)基接種5個(gè)平皿，分別置于25 ℃、35 ℃、36 ℃、37 ℃及38 ℃含體積百分?jǐn)?shù)為5%CO2的恒溫箱中培養(yǎng)。觀察菌落生長(zhǎng)情況并計(jì)算酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化率?！窘Y(jié)果】 在38 ℃，平皿轉(zhuǎn)化率為25%(只有1株菌發(fā)生了轉(zhuǎn)化);在35 ℃和37 ℃時(shí)，平皿轉(zhuǎn)化率分別是60%和85%;而在36 ℃時(shí)平皿轉(zhuǎn)化率僅為45%。使用50 mg/kg羊血BHI和0.5%GSBHI培養(yǎng)基培養(yǎng)，65%培養(yǎng)皿上的菌株發(fā)生了酵母相轉(zhuǎn)化，使用BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)，45%培養(yǎng)皿上的菌株發(fā)生了酵母相轉(zhuǎn)化，而使用SDA和PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，只有20%培養(yǎng)皿上的菌株發(fā)生了酵母相轉(zhuǎn)化。37 ℃時(shí)，有3株菌在BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培養(yǎng)基上的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均達(dá)到90%，1株菌在SDA、PDA和BHI培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)化率均低于10%。【結(jié)論】 溫度是影響申克孢子絲菌酵母相轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分亦是影響轉(zhuǎn)化效果的重要因素。

【關(guān)鍵詞】 申克孢子絲菌; 酵母相轉(zhuǎn)化; 溫度; 培養(yǎng)基

Abstract： 【Objective】 To investigate the effect of temperature and media on mycelium-to-yeast transformation of Sporothrix schenckii. 【Methods】 The clinical isolates 4 were inoculated on plates of media after reactivation. Each isolate was inoculated on plates of SDA， PDA， BHI， 50 mg/kg goat blood BHI and 5 mg/kg GSBHI， and 5 plates of each media were prepared because isolates of each meida were incubated at 25 ℃， 35 ℃， 36 ℃， 37 ℃， and 38 ℃. Growth of Sporothrix schenckii was observed and rates of transformation were calculated. 【Results】 At 38 ℃， the transformations rates were 25%(the only one Strain converted yeast). At 35 ℃ and 37 ℃， the transformations rates were 60% and 85%， respectively. At 36 ℃， the transformations rates were 45%. There were 13 of 20 plates converting yeast when 5% goat blood BHI and 0.5%GSBHI were used， 9 of 20 plates when BHI was used， 4 of 20 plates when SDA and PDA were used. At 37 ℃， transformation rates of 3 isolates reached 90% on medium of BHI， 50 mg/kg goat blood BHI和5 mg/kg GSBHI; However， the transformation rates of 1 isolate were less than 10% on SDA， PDA， and BHI. 【Conclusion】 Temperature is the key factor that affects mycelium-to-yeast transformation of Sporothrix schenckii， nourishments of media may also be necessary for transformation.

申克孢子絲菌屬于雙相型真菌，在自然界或室溫培養(yǎng)為菌絲相，在體內(nèi)或37 ℃培養(yǎng)為酵母相。申克孢子絲菌感染可導(dǎo)致孢子絲菌病，不僅可以引起皮膚組織的病變，還可侵犯內(nèi)臟器官引起系統(tǒng)性病變，嚴(yán)重危害著人類(lèi)的健康[1-2]。酵母相是申克孢子絲菌的致病相，申克孢子絲菌在體內(nèi)從菌絲相到酵母相的轉(zhuǎn)化是致病的一個(gè)關(guān)鍵步驟[3-4]。目前關(guān)于酵母相轉(zhuǎn)化的研究多集中在基因水平[5-6]，而對(duì)于與致病性同樣緊密相關(guān)的生化特點(diǎn)研究較少。本文研究了不同溫度和培養(yǎng)基在申克孢子絲菌酵母相轉(zhuǎn)化中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

菌株SUMS0382、SUMS0383、BMU02035和BMU00471經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為申克孢子絲菌。SUMS0382和SUMS0383分離自我科淋巴管型孢子絲菌病患者，BMU02035和BMU00471由北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心惠贈(zèng)，亦分離自孢子絲菌病患者。

1.2 培養(yǎng)基

沙堡弱瓊脂(Sabouraud?蒺s agar， SDA)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar， PDA)基、腦心浸汁瓊脂(brain heart infusion agar， BHI)基、含50 mg/kg去纖維蛋白羊血清的腦心浸汁瓊脂基(brain heart infusion agar plus 50 mg/kg goat blood， 50 mg/kg羊血BHI)及含5 mg/kg葡萄糖腦心浸汁瓊脂基(brain heart infusion agar plus 5 mg/kg Glucose， 5 mg/kg GSBHI)，pH值均為7.0，購(gòu)自廣州市迪景微生物技術(shù)有限公司。

1.3 菌株活化

將實(shí)驗(yàn)菌株接種于 PDA 斜面培養(yǎng)基上，在含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2 25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每隔7 d傳代1次，連續(xù)傳代2次，光鏡下檢查菌落形態(tài)，以保證菌株的純度和生長(zhǎng)活力。

1.4 酵母相轉(zhuǎn)化

于超凈工作臺(tái)內(nèi)，采用劃線接種法將每株菌分別接種于SDA、PDA、BHI、50 mg/kg羊血BHI及5 mg/kg GSBHI 5種培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基接種5個(gè)平皿，分別置于25、35、36、37及38 ℃含5%的體積分?jǐn)?shù)為CO2恒溫溫箱中培養(yǎng)。觀察菌落生長(zhǎng)情況，每5 d傳代1次，連續(xù)傳代3次。

在所有平皿上的菌株傳代3次生長(zhǎng)至第5天時(shí)，用接種環(huán)挑取少量菌落，置于滅菌載玻片上，滴加乳酸酚棉蘭或酚紅染色后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌落形態(tài)。參照文獻(xiàn)[7]計(jì)算每個(gè)平板上菌株的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化率 > 10%為酵母相轉(zhuǎn)化成功。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用精確概率法對(duì)所有菌株在不同溫度和培養(yǎng)基下轉(zhuǎn)化率的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)軟件使用SPSS 16.0， P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 菌株活化

4 株申克孢子絲菌經(jīng)活化后均生長(zhǎng)良好，形成棕褐色有皺褶的典型菌落。

2.2 酵母相轉(zhuǎn)化

2.2.1 申克孢子絲菌在不同溫度的酵母相轉(zhuǎn)化

在25 ℃的培養(yǎng)條件下，5種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株均表現(xiàn)為明顯的絲狀菌落，不能轉(zhuǎn)化為酵母相。在38 ℃時(shí)，25%培養(yǎng)基平皿上的菌株發(fā)生了酵母相轉(zhuǎn)化(為菌株BMU00471，其余菌株均不能生長(zhǎng))。35 ℃和37 ℃時(shí)分別有60%(12/20)和85%(17/20)培養(yǎng)基平皿上的菌株發(fā)生了酵母相轉(zhuǎn)化。36 ℃時(shí)僅有45%(9/20)培養(yǎng)基平皿上的菌株發(fā)生了酵母相轉(zhuǎn)化(表1)。菌株在各溫度下的轉(zhuǎn)化率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.001)。在光鏡下計(jì)數(shù)不同溫度時(shí)50 mg/kg羊血BHI培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的4株申克孢子絲菌酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，發(fā)現(xiàn)所有菌株在35 ℃和37 ℃的轉(zhuǎn)化率均明顯高于36 ℃和38 ℃，對(duì)于菌株BMU00471，其在35 ℃和37 ℃的轉(zhuǎn)化率均可達(dá)到90%;38 ℃時(shí)所有菌株的轉(zhuǎn)化率最低，菌株SUMS0382、SUMS0383、BMU02035均低于10%(圖1)。不同溫度下的酵母相菌落均在轉(zhuǎn)種后的第2天開(kāi)始出現(xiàn)，在第2 ～ 4天生長(zhǎng)迅速，在第5天生長(zhǎng)變得緩慢。在含5%去纖維蛋白羊血清的BHI培養(yǎng)基上，菌株BMU00471在35、36、37和38 ℃均可以轉(zhuǎn)化為酵母相。在35 ℃和37 ℃時(shí)，酵母細(xì)胞生長(zhǎng)良好，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)90%的菌絲可轉(zhuǎn)化為酵母細(xì)胞;在36 ℃，酵母相菌株生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，光鏡下仍可見(jiàn)到較多的菌絲片段和孢子;在38 ℃，菌株生長(zhǎng)速度較36 ℃時(shí)快，但在光鏡下發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞數(shù)量較36 ℃少(圖2)。

2.2.2 申克孢子絲菌在不同培養(yǎng)基上的酵母相轉(zhuǎn)化

在營(yíng)養(yǎng)豐富的50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培養(yǎng)基平皿上，酵母相轉(zhuǎn)化率均為65%，且生長(zhǎng)最為旺盛;BHI培養(yǎng)基次之為45%;SDA和PDA培養(yǎng)基最少均為20%，且菌株在不同培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)化率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P = 0.002，表2)。35 ℃時(shí)，在SDA和PDA培養(yǎng)基上菌株以菌絲相生長(zhǎng)，而在BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培養(yǎng)基上則以酵母相生長(zhǎng)。36 ℃時(shí)，在SDA和PDA培養(yǎng)基上菌株不能生長(zhǎng)，在BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培養(yǎng)基上則以酵母相生長(zhǎng)。37 ℃時(shí)，菌株SUMS0382、BMU02035和BMU00471在BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培養(yǎng)基上的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均達(dá)到90%;菌株SUMS0383在SDA、PDA和BHI培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)化率均低于10%(圖3)。不同培養(yǎng)基上的酵母相菌落均在轉(zhuǎn)種后的第2天開(kāi)始出現(xiàn)，在第2 ～ 4天生長(zhǎng)迅速，在第5天生長(zhǎng)變得緩慢。 在35 ℃時(shí)，菌株BMU00471在BHI、50 mg/kg羊血BHI及5 mg/kg GSBHI培養(yǎng)基上均可轉(zhuǎn)化為酵母相，且生長(zhǎng)良好，光鏡下觀察可見(jiàn)轉(zhuǎn)化良好的呈“雪茄”樣的酵母細(xì)胞(圖4);而在SDA及PDA培養(yǎng)基上，菌株BMU00471呈現(xiàn)不典型的絲狀菌落，并可產(chǎn)生棕素，光鏡下可見(jiàn)大量的菌絲及“梅花”樣孢子(圖4)。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)在36 ℃時(shí)4株申克孢子絲菌臨床分離株均可以轉(zhuǎn)化為酵母相，而在以往僅Lima等[8]報(bào)道1株申克孢子絲菌在動(dòng)物體內(nèi)傳代以后才具備在36 ℃發(fā)生酵母相轉(zhuǎn)化的能力。在我們的研究中，36 ℃時(shí)有45%培養(yǎng)基平皿上的申克孢子絲菌發(fā)生了酵母相轉(zhuǎn)化，但其酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化率明顯低于35 ℃和37 ℃時(shí)的轉(zhuǎn)化率。36 ℃時(shí)菌株轉(zhuǎn)化數(shù)量及轉(zhuǎn)化率卻同時(shí)低于35 ℃和37 ℃，其內(nèi)在機(jī)制在進(jìn)一步研究中。

本研究發(fā)現(xiàn)，35 ℃和37 ℃是申克孢子絲菌酵母相轉(zhuǎn)化的適宜溫度，與以往的研究相符[7]。在35 ℃和37 ℃，無(wú)論是發(fā)生轉(zhuǎn)化的菌株數(shù)量還是酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，均明顯高于36 ℃和38 ℃。但35 ℃和37 ℃哪個(gè)更適合申克孢子絲菌的酵母相轉(zhuǎn)化呢?我們的研究顯示，在37 ℃而不是35 ℃，發(fā)生酵母相轉(zhuǎn)化的菌株數(shù)量最多，酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化率最高，與Dixon等[7]研究顯示的35 ℃適合申克孢子絲菌環(huán)境分離株的酵母相轉(zhuǎn)化，而37 ℃適合臨床分離株的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象一致。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)分離自固定型孢子絲菌病的菌株只能在35 ℃發(fā)生酵母相轉(zhuǎn)化，分離自淋巴管型孢子絲菌病的菌株無(wú)論在35 ℃還是37 ℃均可發(fā)生酵母相轉(zhuǎn)化[9]。本研究中分離自皮膚淋巴管型孢子絲菌病患者的菌株SUMS0382和SUMS0383，既可在35 ℃也可在37 ℃發(fā)生酵母相轉(zhuǎn)化。在38 ℃僅菌株BMU00471可以轉(zhuǎn)化為酵母相，其余菌株不能生長(zhǎng)。Ghosh等[10]的研究顯示申克孢子絲菌在30 ～ 37 ℃生長(zhǎng)良好，在40 ℃生長(zhǎng)受到了抑制，并沒(méi)有明確指出在38 ℃申克孢子絲菌是否能夠生長(zhǎng)和發(fā)生轉(zhuǎn)化。有學(xué)者證明鈣調(diào)蛋白激酶可以調(diào)控申克孢子絲菌從菌絲相到酵母相的轉(zhuǎn)化[4]。我們推測(cè)溫度在申克孢子絲菌酵母相轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用可能與鈣調(diào)蛋白激酶的活性有關(guān)。

本研究首次發(fā)現(xiàn)在臨床常使用的PDA和SDA培養(yǎng)基上，申克孢子絲菌可以轉(zhuǎn)化為酵母相，然而營(yíng)養(yǎng)豐富的BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培養(yǎng)基上發(fā)生酵母相轉(zhuǎn)化的申克孢子絲菌數(shù)量和酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率明顯高于PDA和SDA培養(yǎng)基，可見(jiàn)營(yíng)養(yǎng)成分是影響申克孢子絲菌酵母相轉(zhuǎn)化的重要條件。以往文獻(xiàn)[10-12]報(bào)道申克孢子絲菌的酵母相轉(zhuǎn)化使用的培養(yǎng)基有胱氨酸葡萄糖血瓊脂基、BHI、含50 mg/kg去纖維蛋白羊血的BHI和胰蛋白酶大豆瓊脂基，均可獲得較好的轉(zhuǎn)化率，我們利用含5 mg/kg葡萄糖的BHI培養(yǎng)基對(duì)申克孢子絲菌進(jìn)行酵母相轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化菌株的數(shù)量和酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化率與含50 mg/kg去纖維羊血BHI培養(yǎng)基的一致，值得在臨床推廣。

研究顯示不同培養(yǎng)基上的酵母相菌落均在轉(zhuǎn)種后的第2天開(kāi)始出現(xiàn)，在第2 ～ 4天生長(zhǎng)迅速，在第5天生長(zhǎng)變得緩慢，與Robert[13]在電鏡下觀察到的時(shí)間一致。但Hempel[14]將豚鼠的外周巨噬細(xì)胞加入培養(yǎng)基中，可將申克孢子絲菌酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化時(shí)間縮短至24 h。

總之，本研究通過(guò)探討不同溫度和培養(yǎng)基在申克孢子絲菌酵母相轉(zhuǎn)化中的作用，明確了溫度是影響申克孢子絲菌酵母相轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分亦是影響轉(zhuǎn)化效果的重要因素，從而進(jìn)一步證實(shí)了申克孢子絲菌酵母相轉(zhuǎn)化條件的多樣性，為抑制申克孢子絲菌在體內(nèi)的酵母相轉(zhuǎn)化，阻斷其致病機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。

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