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生物細胞的培養(yǎng)范文第1篇

【摘要】 為進一步提高臍血造血細胞的擴增倍數(shù)并達到臨床規(guī)模，本研究中利用自主開發(fā)的有溶氧和pH控制的攪拌式生物反應(yīng)器進行了臍血造血細胞的換液培養(yǎng)。結(jié)果表明，培養(yǎng)中總細胞、CD34+細胞、各系集落形成細胞(CFU-GM，BFU-E，CFU-Mix，CFU-Mk)的擴增倍數(shù)均高于方瓶培養(yǎng)，而且由于控制了較低的溶氧，所培養(yǎng)細胞中干/祖細胞含量顯著高于方瓶培養(yǎng)。該反應(yīng)器中培養(yǎng)的臍血造血細胞達到了臨床應(yīng)用的規(guī)模。結(jié)論：反應(yīng)器中培養(yǎng)環(huán)境更有利于干/祖細胞的維持和擴增，而且可達到成人造血干細胞移植所需細胞量。

【關(guān)鍵詞】 臍血

Ex vivo Culture of Umbilical Cord Blood Hematopoietic Cells in Stirred Tank Bioreactor with feeding protocol

Abstract To increase the expansion multiple of cord blood (CB) hematopoietic cells and to reach a scale for clinical application，the mononuclear cells from CB were cultured in a autonomously developed stirred tank bioreactor with dissolved oxygen (DO) and pH controlling. The result showed that the expansion multiple of total cells，CD34+ cells，and progenitors cells (CFU-GM，BFU-E，CFU-Mix，and CFU-Mk) in bioreactor were greater than that in T-flasks. The rate of progenitors to total cells in bioreactor culture was also greater than that in T-flasks. The good results in bioreactor should be attributed to the controlled，optimized DO. Clinical-scale culture was realized from one sample of CB in this bioreactor. These results suggested that the culture environment in bioreactor with optimal DO and pH controlling is more favorable for stem/progenitor cell maintenance and expansion，and the expanded cells from one sample of CB is enough to transplant for an adult patient.

Key words cord blood；hematopoietic cell；bioreactor；stirred culture

臍血細胞中富含造血干細胞，從而成為除骨髓和外周血之外一個重要造血干細胞來源，在臨床上有著廣泛應(yīng)用，但臍血中造血干細胞的絕對數(shù)量少，無法滿足成人的移植要求，而通過體外培養(yǎng)和擴增有望克服這一矛盾。體外擴增骨髓細胞、外周血細胞、臍血細胞的臨床實驗都已有所報道［1，2］，證明了體外擴增后細胞用于臨床的安全性和可行性。目前開發(fā)的體外擴增造血干細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)主要有平板灌注腔反應(yīng)器、固定床和流化床反應(yīng)器、攪拌式反應(yīng)器等［3］。其中攪拌式生物反應(yīng)器能提供均一的培養(yǎng)環(huán)境，而且取樣和數(shù)據(jù)采集簡單，易于實現(xiàn)自動控制，因此，在造血細胞臨床規(guī)模培養(yǎng)中有較好的應(yīng)用前景［3，4］。本研究應(yīng)用自主開發(fā)的攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，進行臍血造血細胞的換液培養(yǎng)研究。

材料和方法

臍血(CB)和單個核細胞(MNC)的分離

臍血由上海國際和平婦嬰保健院提供。供者要求是身體健康、發(fā)育良好的非高齡產(chǎn)婦。臍血經(jīng)淋巴細胞分離液(Ficoll)密度梯度離心后，收集單個核細胞，并以IMDM培養(yǎng)液洗滌2次。

培養(yǎng)基和細胞因子

體外培養(yǎng)液用IMDM（Gibco公司），使用時添加20％胎牛血清(FBS)，以及SCF（50 ng/ml）、IL-3（5 ng/ml）、IL-6（20 ng/ml）、G-CSF（2.0 ng/ml）和GM-CSF（2.0 ng/ml），其中SCF、IL-6購于北京寶賽生物技術(shù)公司，IL-3購于Pepro-Tech公司，G-CSF購于上海三維制藥廠，GM-CSF購于上海海濟生物技術(shù)有限公司。

造血細胞的反應(yīng)器換液培養(yǎng)

將分離得到的臍血單個核細胞以2×106 cells/ml的密度在 T-175方瓶中培養(yǎng)4天后，再接種到反應(yīng)器中或T-25型方瓶（Nunc公司）中進行培養(yǎng)，進行的2次實驗中接種密度均為0.8×106 cells/ml。反應(yīng)器為自主開發(fā)產(chǎn)品，其中反應(yīng)器中所用材料經(jīng)過造血細胞的生物相容性檢驗，反應(yīng)器工作體積為300-500 ml，攪拌系統(tǒng)為磁力攪拌，轉(zhuǎn)速控制為30 r/min。反應(yīng)器的溫度控制為37℃，溶氧和pH通過調(diào)節(jié)空氣、氮氣、氧氣和二氧化碳的流量來控制，通氣方式為表面通氣。pH控制在7.15，溶氧控制為飽和溶解空氣的25％。細胞接種到反應(yīng)器后，待細胞密度生長至2.0×106 cells/ml后進行換液，即取出50％的細胞液，并加入相同體積含有相同細胞因子的新鮮培養(yǎng)液。實驗中以T-25方瓶作對照，每瓶裝液7 ml，置于37℃、5％ CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)，方瓶與反應(yīng)器中換液比例和頻率相同。

細胞計數(shù)及活性分析

臺盼藍染色后利用血球計數(shù)器進行活細胞和總細胞的計數(shù)，由于實驗中很少能見到被染成藍色的細胞（死細胞），因此，未進一步計算細胞活性。

造血細胞的集落檢測

集落的檢測體系為IMDM培養(yǎng)液，添加20％胎牛血清（FBS），4 mmol/ml谷氨酰胺（Sigma），含0.9％甲基纖維素(4 000cp，Sigma)，以及人重組造血生長因子SCF、IL-3、IL-6、GM-CSF、G-CSF、 EPO，其濃度分別為50、20、20、20、20 ng/ml和2 U/ml，并添加1％牛血清白蛋白（BSA）。取(1-3)×104培養(yǎng)或沒培養(yǎng)的單個核細胞加入0.5 ml集落培養(yǎng)液中，置于37℃、5％ CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12天后，進行CFU-GM、BFU-E、CFU-Mix計數(shù)，其中CFU-Mix為至少含有粒細胞和紅細胞的集落。

CFU-Mk的檢測采用血漿塊法，細胞以1×105 cells/ml的接種密度接種于24孔板中，每孔加50 μl臍血漿，50 μl 3.4 g/L的CaCl2溶液，另加入含有TPO （20 ng/ml）、IL-3（10 ng/ml）、IL-6（10 ng/ml）的α培養(yǎng)基（Gibco公司），混勻后靜置凝固。培養(yǎng)10-12天后，用1∶3的甲醇/丙酮溶液原位脫水，并固定30分鐘，然后按次序加入1% BSA、鼠抗人CD41抗體、生物素標記的羊抗鼠IgG抗體、抗生物素蛋白-堿性磷酸酯酶復(fù)合物（加入后都要作用一定時間，然后用0.05 mol/L Mtris/NaCl緩沖液淋洗3遍，再加入其它試劑），染色后在40×目鏡下觀測呈紅色的集落。

細胞表型分析

流式細胞儀分析中所用抗體為PharMingen公司產(chǎn)品。取1.0×106未擴增或擴增后的細胞加入1.5 ml離心管中，用PBS洗2遍，離心后倒掉上清液，加PE偶聯(lián)的小鼠抗人CD34單克隆抗體和FITC偶聯(lián)的小鼠抗人CD45單克隆抗體各10 μl，4℃孵育30分鐘。PBS洗2遍，離心后，每管加1 ml FACS保存液；標記抗體后的細胞用流式細胞儀（Becton Dickinson公司）分析，結(jié)果用Lysis II軟件處理。

結(jié)

果

總細胞的擴增

由圖1可見，換液培養(yǎng)時，總細胞在18天的培養(yǎng)中一直維持擴增，在開始的14天中反應(yīng)器和方瓶中總細胞擴增倍數(shù)相差不大，14天后開始有所差別，說明培養(yǎng)到后期方瓶中細胞增殖潛力不如反應(yīng)器。擴增到18天時，兩批實驗反應(yīng)器中總細胞分別擴增37.2倍和26.3倍，方瓶低于反應(yīng)器中擴增倍數(shù)。

干/祖細胞的擴增

CFU-Mix由于具有多向分化潛能，代表了較原始的干/祖細胞，換液培養(yǎng)中CFU-Mix擴增情況如圖2所示，兩次實驗反應(yīng)器中CFU-Mix的擴增分別在第10天和第9天達到最大，擴增倍數(shù)分別為7.7和8.9，方瓶中第7-8天達到最大，而后逐漸下降，其擴增倍數(shù)明顯低于反應(yīng)器中。反應(yīng)器中培養(yǎng)至14天仍可檢測到CFU-Mix，而方瓶中10天后僅能檢測到很少的CFU-Mix。

CFU-GM的擴增在14天左右達到最大，而后維持數(shù)天，或有所下降，而方瓶中擴增倍數(shù)在第10天達到最大，而后開始較快下降，而反應(yīng)器中CFU-GM擴增倍數(shù)一直高于方瓶，最大擴增倍數(shù)分別為27.4和23.6，顯著高于方瓶（圖2）。

BFU-E達到最大擴增倍數(shù)的時間較早，在7天左右，由于本實驗中沒有添加EPO，所以BFU-E的擴增倍數(shù)不高，由圖2可以看出，反應(yīng)器中擴增倍數(shù)一直高于方瓶。

反應(yīng)器中CFU-Mk的擴增倍數(shù)在10天時達到最大，而后逐漸下降，14天后基本檢測不到CFU-Mk，而方瓶中第7-9天達到最大后就開始較快地下降。擴增最大時，兩次實驗反應(yīng)器中分別擴增10.3倍和14.4倍（圖2）。

培養(yǎng)中CD34+細胞的擴增如圖3所示，反應(yīng)器擴增倍數(shù)一直上升，至14天時達到最大，方瓶培養(yǎng)到第7天時與反應(yīng)器相差不大，第10天開始有較大差異，第14天的擴增倍數(shù)比第10天時提高不大。由圖看見最終反應(yīng)器中CD34+細胞的擴增倍數(shù)高于方瓶培養(yǎng)。

反應(yīng)器培養(yǎng)的規(guī)模

附表顯示了2次實驗中反應(yīng)器培養(yǎng)的規(guī)模，由附表可見，如果不取出細胞而采用流加方式培養(yǎng)細胞，則培養(yǎng)到12天時，第1次實驗中可得到2.44×109總細胞、4.88×106 CFU-Mix、11.9×106 CFU-GM和59.5×106 CD34+細胞，第2次實驗可得到2.03×109總細胞、3.53×106 CFU-Mix、9.0×106 CFU-GM、和36.7×106 CD34+細胞。

造血干細胞移植中細胞需要達到的理想量是總細胞3.7×107 cells/kg，和CFU-GM 2.0×105 cells/kg，CD34+細胞2.5×106 cells/kg。按此計算，對于1個50公斤體重的病人總細胞、CFU-GM、CD34+細胞必須分別達到1.85×109、 10×106、和125×106 個。我們的檢測中是作同一集落分析而分別計數(shù)CFU-GM 和CFU-Mix，而CFU-Mix是比CFU-GM更原始的細胞，因此，這兩個數(shù)字應(yīng)該相加再與文獻中所述的CFU-GM量相比才是科學(xué)的，從總細胞和集落形成細胞數(shù)來說，反應(yīng)器培養(yǎng)所得細胞可達到理想量的要求。CD34+細胞數(shù)雖然小于理想量，但也可滿足最低量25×106細胞的要求。因此，如果利用該反應(yīng)器一直補料培養(yǎng)，可以從一份臍血培養(yǎng)得到足夠用于臨床的細胞量。

討 論

造血干/祖細胞移植目前在臨床中主要用于造血干/祖細胞缺陷性血液病、先天性免疫病、各類自身免疫病、及實體瘤的治療，是一種重要的細胞治療手段。臍血造血干/祖細胞作為一種造血干/祖細胞來源，

由于數(shù)量較少，在臨床上只能用于兒童患者，要應(yīng)用于成人患者則必須通過體外擴增增加其數(shù)量，其中培養(yǎng)環(huán)境中的溶氧、pH、細胞因子、培養(yǎng)方式等對擴增效果有重要影響。因此，要實現(xiàn)造血干細胞體外擴增技術(shù)在臨床上應(yīng)用，需要開發(fā)出足夠大規(guī)模、標準化的培養(yǎng)系統(tǒng)以及相應(yīng)的擴增工藝。本研究采用攪拌式生物反應(yīng)器在臨床規(guī)模擴增了臍血單個核細胞，擴增得到的細胞中代表造血干/祖細胞的CD34+細胞、CFU-GM、CFU-Mk等細胞的含量均較常規(guī)的靜態(tài)培養(yǎng)高，更適于臨床應(yīng)用。而且，其培養(yǎng)規(guī)模達到了臨床應(yīng)用中所需移植細胞量的要求。

溶氧是造血細胞發(fā)育的重要調(diào)控因子，很多報道都表明，低氧分壓（1％-5％）比正常氧分壓（20％）有利于造血干/祖細胞的維持和擴增［6］，因此，我們在生物反應(yīng)器中控制的溶氧為飽和空氣的25%，這與5％氧分壓相當。實驗表明，反應(yīng)器培養(yǎng)中不但細胞擴增倍數(shù)高，所得細胞中CFU-GM、CFU-Mix、CFU-Mk，CD34+細胞的含量都高于方瓶培養(yǎng)的結(jié)果，而且維持時間比方瓶中長，這應(yīng)該與反應(yīng)器中所維持的低溶氧有關(guān)。

值得注意的是，在本系統(tǒng)中雖然在一定程度上可以減緩造血干/祖細胞的分化速度，但并不能從根本上解決培養(yǎng)過程中造血干/祖細胞的分化問題。另外，本實驗中所檢測的各類集落形成細胞及CD34+細胞都僅能代表造血祖細胞，因此其擴增情況只能代表祖細胞的擴增，如果要確定造血干細胞是否真正實現(xiàn)了擴增，則需要進行SCID小鼠體內(nèi)造血重建實驗才能夠確定。

Collins等［3］也用400 ml的有pH和溶氧控制的反應(yīng)器進行了臍血造血細胞的培養(yǎng)，其2次實驗中總細胞分別擴增了約35倍和200倍，而CFU-GM分別擴增了約23倍和30倍，我們的結(jié)果與之相比相差不大。Kim等［7］在不控制pH和溶氧的轉(zhuǎn)瓶中進行了骨髓造血細胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)中只添加細胞因子組合IL-3、SCF、GM-CSF和EPO，結(jié)果總細胞和CFU-GM只擴增了8倍和5倍。在此基礎(chǔ)上添加基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基顯著提高了總細胞的擴增，CFU-GM擴增也提高到了17倍，CFU-GM含量大大增加。我們的實驗中所添加的細胞因子為IL-3、IL-6、SCF、GM-CSF和G-CSF，其中促分化的IL-3、GM-CSF和G-CSF添加量都較小，分別為5 ng/ml、2 ng/ml、2 ng/ml，這對防止細胞過早分化有一定作用。如果在此基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化培養(yǎng)基，如添加基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基或FL和TPO等能促進干細胞增殖的細胞因子等，有望進一步提高造血干/祖細胞的增殖。

除造血干/祖細胞外，為縮短粒細胞和血小板的恢復(fù)期，以及為放療和化療提供輔助治療，臨床中對粒細胞、巨核細胞、紅細胞等成熟細胞的需求也很大，因此，培養(yǎng)成熟細胞也是造血細胞體外擴增的重要內(nèi)容之一。Neildez-Nguyen等［8］在體外培養(yǎng)紅細胞前體細胞的實驗中所培養(yǎng)的總細胞數(shù)達1010個，這些前體細胞在輸入小鼠體內(nèi)后可分化為成熟的紅細胞，對于如此大規(guī)模的成熟細胞培養(yǎng)，應(yīng)用攪拌式生物反應(yīng)器將更有優(yōu)勢。

【參考文獻】

1Jaroscak J，Goltry K，Smith A，et al. Augmentation of umbilical cord blood (UCB) transplantation with ex vivo-expanded UCB cells: results of a phase I trial using the AastromReplicell System. Blood，2003；101: 5061-5067

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3Cabral J M S. Ex vivo expansion of hematopoietic stem cells in bioreactors (review). Biotechnology Letters，2001；23: 741-751

4Collins PC，Miller WM，Papoutsakis ET. Stirred culture of peripheral and cord blood heatopoietic cells offers advantages over traditional static systems for clinically relevant applications. Biotechnol Bioeng，1998；59: 534-543

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6Hevehan DL，Papoutsakis ET，Miller WM. Physiologically significant effects of pH and oxygen tension on granulopoiesis. Exp Hematol，2000；28: 267-275

生物細胞的培養(yǎng)范文第2篇

關(guān)鍵詞：醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)實驗；創(chuàng)新能力；培養(yǎng)方法

中圖分類號：G642 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2013）32-0123-02

近年來，人類在醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)取得的成就對現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展起到巨大的推動作用，它為人們從細胞和分子水平認識人類疾病的發(fā)生和發(fā)展提供了理論依據(jù)和重要的技術(shù)手段。醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)同時作為生理學(xué)、免疫學(xué)、組織胚胎學(xué)、藥理學(xué)等重要基礎(chǔ)理論課程的基礎(chǔ)，醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)又與臨床醫(yī)學(xué)的其他各個學(xué)科緊密相連，為醫(yī)學(xué)生進一步學(xué)習(xí)其他醫(yī)學(xué)課程奠定基礎(chǔ)[1]。醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)實驗是醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)教學(xué)的重要組成部分，提高醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)實驗的教學(xué)水平對于提高整體的醫(yī)學(xué)教育水平有重要的推動作用。在實驗教學(xué)過程中如何提高學(xué)生分析問題和解決問題的能力、培養(yǎng)學(xué)生的實踐能力和創(chuàng)新能力成為十分重要的任務(wù)。為此筆者根據(jù)我院醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)實驗的教學(xué)實際情況，就在醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)實驗教學(xué)中培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力提出自己的幾點建議，以供探討。

一、實驗教學(xué)與理論教學(xué)將結(jié)合，正確引導(dǎo)和激發(fā)學(xué)生的實驗欲望

孔子說：知之者不如好知者，好知者不如樂知者。興趣是最好的老師。很多學(xué)生在高中就接觸過一些生物學(xué)實驗，但是比較簡單，而且動手的機會并不多。大多數(shù)學(xué)生直接動手做實驗的興趣很強，但是此時學(xué)生的實驗興趣都停留在對實驗本身的好奇心上，對于“為什么會這樣設(shè)計實驗”和“這樣設(shè)計實驗會出現(xiàn)幾種結(jié)果”等問題缺乏深層次的思考。教師要學(xué)會合理利用學(xué)生的好奇心，認真加以引導(dǎo)，把學(xué)生的好奇心轉(zhuǎn)化為理性思考支配下的求知欲。細胞生物學(xué)的概念、原理和規(guī)律都是通過大量的實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過一系列縝密的推理論證得到的，每一個重要的原理和規(guī)律的背后都有一系列經(jīng)典的實驗去證明它。比如：在理論課講授細胞分化的本質(zhì)特征是基因選擇性表達的時候，我們重點講解如何證明這一結(jié)論的實驗——通過采用Northern和Southern的方法來檢測三種組織來源不同的細胞（紅細胞、胰島細胞、輸卵管上皮細胞）中三種特異表達基因的DNA和mRNA的情況。通過對實驗背景、實驗方法以及實驗過程的詳細講解，引導(dǎo)學(xué)生在自己的頭腦中“進行實驗”，進而讓學(xué)生了解科學(xué)家們是怎么針對研究目標設(shè)計實驗的，在學(xué)生進行“頭腦實驗”的同時又是與科學(xué)家進行科學(xué)思想上的“對話”，增強學(xué)生的興趣和求知欲。最后，讓同學(xué)們思考，為了揭示細胞分化的本質(zhì)，我們自己能否設(shè)計出新的實驗來闡明這一科學(xué)問題。我們通過在理論課上講授一些經(jīng)典的實驗，激發(fā)學(xué)生的實驗興趣和探索未知世界的欲望，探索未知世界的欲望越大，成功的欲望也就越大，創(chuàng)新思維也就越活躍。

二、在實驗教學(xué)過程中，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力

醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)實驗教學(xué)過程作為培養(yǎng)學(xué)生實驗創(chuàng)新能力的主要環(huán)節(jié)，在這一過程中，通過學(xué)生通過自己親自操作進行創(chuàng)新能力的鍛煉與培養(yǎng)[2]。在理論課上，通過教師對實驗的正確引導(dǎo)，學(xué)生除了對實驗有了正確的認識，同時對實驗的積極性還大大增強，在渴望實驗成功的欲望驅(qū)使下，每個學(xué)生都想在實驗中“一展身手”。根據(jù)已有經(jīng)驗，我們認為在實驗教學(xué)過程中，以下幾點是培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力的關(guān)鍵：①培養(yǎng)嚴謹?shù)膶嶒瀾B(tài)度，嚴格規(guī)范實驗操作。嚴謹?shù)膶嶒瀾B(tài)度是進行創(chuàng)新能力培養(yǎng)的基礎(chǔ)，規(guī)范嚴格的實驗操作是進行創(chuàng)新能力培養(yǎng)的關(guān)鍵，如果學(xué)生缺乏嚴謹?shù)膽B(tài)度，那么他就不可能有規(guī)范的實驗操作，更談不上學(xué)生的實驗?zāi)芰εc創(chuàng)新能力的培養(yǎng)[3]。②培養(yǎng)觀察能力，認真做好實驗記錄。為了避免學(xué)生只重視實驗結(jié)果，我們要求學(xué)生認真記錄下整個實驗過程，讓學(xué)生明白每一步實驗的目的是什么的，會出現(xiàn)什么樣的結(jié)果，省略此步驟，對實驗結(jié)果有什么影響，比如細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的觀察，我們要向?qū)W生提出為什么要在細胞染色之后都要經(jīng)過一步清洗，清洗的目的是什么，讓同學(xué)多做一組省略清洗步奏的裝片，讓學(xué)生通過觀察得出清洗步驟的作用，這樣學(xué)生觀察能力得到提高，分析思維的空間也得到了相應(yīng)的拓展。③鼓勵學(xué)生進行多種嘗試，啟發(fā)學(xué)生的思維。比如我們在洋蔥細胞核觀察的實驗過程中，實驗步驟要求采集洋蔥內(nèi)表皮細胞進行染色觀察，我們鼓勵學(xué)生，讓學(xué)生同時采集洋蔥外表皮的細胞進行觀察，看看能否觀察到細胞核，細胞核的形態(tài)有沒有變化，從而啟發(fā)學(xué)生對細胞核的功能進行深入思考，開闊了思路，激發(fā)創(chuàng)新意識。

此外，在實驗過程中，如果有學(xué)生實驗失敗，很容易產(chǎn)生挫敗感。教師要善于抓住這個“良機”，學(xué)生實驗的失敗是激發(fā)學(xué)生進行深入思考和創(chuàng)造性解決問題的重要時機。告訴學(xué)生，很多重要的發(fā)現(xiàn)都是通過一次次的實驗失敗得來的，愛迪生每失敗一千次實驗才能成功一次。接下來，根據(jù)實驗記錄，和學(xué)生一起尋找失敗的原因，但這不是直接告訴學(xué)生實驗失敗的原因，而是通過一步步的進行引導(dǎo)，讓學(xué)生自己找到實驗失敗的原因。在學(xué)生自己找出實驗失敗的原因的過程中，激發(fā)學(xué)生的思維，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力。

三、邀請專家講座，拓展學(xué)生知識面

拓展學(xué)生的知識面有利于學(xué)生創(chuàng)新能力的培養(yǎng)。醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)屬于實驗性學(xué)科，細胞生物學(xué)知識的獲得均是通過千百次的實驗獲得的知識的總結(jié)和升華，細胞生物學(xué)實驗過程本身需要豐富的創(chuàng)新性。因此我們定期邀請工作在細胞生物學(xué)科研第一線的相關(guān)專家進行做報告，通過專家們通俗易懂的報告，向同學(xué)介紹他們是怎么設(shè)計實驗的，他們采用此種方式設(shè)計實驗的目的是什么？同學(xué)通過了解專家們的思維活動，進而激發(fā)他們的思維，激勵他們在醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)實驗中主動進行創(chuàng)新，進而培養(yǎng)他們的創(chuàng)新能力。

四、定期舉辦學(xué)術(shù)沙龍

定期舉辦學(xué)術(shù)沙龍，通過學(xué)生間的自由討論，激發(fā)學(xué)生思想的火花。我們醫(yī)學(xué)院每年培養(yǎng)五十名左右的研究生，我們充分利用這一資源優(yōu)勢，每學(xué)期舉辦三次學(xué)術(shù)沙龍，每次時間大概兩個小時左右，邀請細胞生物學(xué)方向的研究生與本科生一起參加，教研室的教師充當引導(dǎo)作用的角色，讓本科生與研究生之間進行充分的交流。為了提高學(xué)術(shù)沙龍的效率，我們每次沙龍活動設(shè)定幾個議題，讓學(xué)生圍繞設(shè)定的議題進行充分的討論，另外，我們還專門留出時間，讓每個學(xué)生自由提出他們感興趣的問題，之后師生共同解決。學(xué)術(shù)沙龍我們已經(jīng)舉辦過六期了，學(xué)生的反響和評價都很好。

五、改革考核評價機制，檢驗創(chuàng)新成果

以往醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)實驗的考核方式以學(xué)生提交實驗報告，教師打分的形式進行。學(xué)生只注重完成實驗報告，看不到他們的實際操作情況，學(xué)生只會把主要精力放在完成實驗報告的上來，此外，這種考核形式造成學(xué)生之間相互抄襲的現(xiàn)象存在，教學(xué)效果大打折扣。針對此類現(xiàn)實情況，我們采用多元化的考核方式，考試內(nèi)容包括設(shè)計的能力、實驗操作能力和實驗報告，通過三方面結(jié)合來考核學(xué)生創(chuàng)新能力的培養(yǎng)成果。設(shè)計實驗的能力運用已經(jīng)學(xué)習(xí)的實驗原理、技術(shù)和方法設(shè)計實驗，來達到預(yù)期的目的，學(xué)生通過實驗?zāi)芰Φ臏y試，提高自身對已有實驗的掌握和應(yīng)用能力。通過實驗操作能反映學(xué)生的科學(xué)態(tài)度、科學(xué)精神，全面養(yǎng)成學(xué)生良好的科研習(xí)慣，從而促進學(xué)生綜合素質(zhì)的全面提高。實驗報告?zhèn)戎貙W(xué)生操作步驟、數(shù)據(jù)處理、結(jié)果分析能力進行考察，能夠反映學(xué)生的科學(xué)思維及邏輯推理能力。盡管我們的醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)的實驗教學(xué)改革剛剛起步，但是通過實驗教學(xué)的各個環(huán)節(jié)以提高學(xué)生創(chuàng)新思維為指導(dǎo)，學(xué)生的創(chuàng)新能力得到不同程度的提高，比如在學(xué)校進行的大學(xué)生科技創(chuàng)新大賽中，醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)的相關(guān)實驗研究受到了學(xué)院的好評。同時與未進行實驗改革的前幾屆學(xué)生相比，學(xué)生們的基本操作、動手能力和運用知識的能力得到顯著的提高。

參考文獻：

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[3]殷祥超.改革專業(yè)實驗教學(xué)培養(yǎng)學(xué)生的綜合素質(zhì)[J].實驗室研究與探索，2003，2：31-33.

生物細胞的培養(yǎng)范文第3篇

[關(guān)鍵詞]細胞微環(huán)境；無血清培養(yǎng)體系；再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域

中圖分類號：R329 文獻標識碼：A 文章編號：1009-914X（2016）21-0308-01

1 無血清培養(yǎng)體系簡介

無血清培養(yǎng)體系是在合成培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，主要是尋找替代血清的各種可能性，使無血清培養(yǎng)既能進行細胞培養(yǎng)，又可以避免血清帶來的不利影響。與含血清培養(yǎng)相比，具有很多的優(yōu)點，無血清培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展是從上世紀七十年代開始的，其中基于生產(chǎn)安全性的重組藥物而開發(fā)的無血清培養(yǎng)基，不用動物做為蛋白來源，降低了成本也加快了報批的速度，后來逐漸發(fā)展成為培養(yǎng)基的組成成分全部為化學(xué)已知物，更易進行目標蛋白的分離純化，要求培養(yǎng)的細胞要具有較高的特異性。

一般無血清培養(yǎng)體系由基礎(chǔ)培養(yǎng)和替代血清補充因子兩部分組成，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)是零添加血清的合成培養(yǎng)基，按照細胞的生長要求將各種微量元素和營養(yǎng)物質(zhì)進行合成為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。補充因子是代替血清的各種因子，包括激素、生長因子、結(jié)合蛋白等，在所有的補充因子中，胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉是細胞在無血清培養(yǎng)基中生長所必須的，是必須具備的補充因子。

2 無血清培養(yǎng)體系在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

2.1 無血清培養(yǎng)基研制配方的應(yīng)用

研究人員研究發(fā)現(xiàn)在無血清合成輸卵管液培養(yǎng)基中加入胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和硒，可以提高動物胚胎的發(fā)育質(zhì)量，再加入牛血清白蛋白后，可以促進囊胚的發(fā)展，可以促進細胞的增殖實驗。CHO、Vero等工程細胞是單克隆抗體和基因工程藥物的表達載體，在對無血清培養(yǎng)基的研制時，要滿足增殖的需要，同時也要表達目的產(chǎn)物。例如CS-NS0細胞是抗-CD25單克隆抗體的表達體，無血清低蛋白培養(yǎng)基可以滿足大規(guī)模培養(yǎng)和抗體表達的要求，批培養(yǎng)最大活細胞密度和最大抗體濃度都達到很高?；谌伺吣I細胞培養(yǎng)的無蛋白培養(yǎng)基，可以用于對抗聚乙烯介導(dǎo)轉(zhuǎn)染慢病毒，具有較高的滴度，成本也較低。針對Vero細胞源乙型腦炎疫苗而研制的無血清培養(yǎng)基，沒有任何動物源性成分，疫苗只要添加穩(wěn)定劑，就可以在常溫下保存。

2.2 無血清培養(yǎng)體系在細胞增殖方面的應(yīng)用

雌二醇是無血清培養(yǎng)基中經(jīng)常添加的激素，如果其濃度較高，會抑制毛囊的生長；PDGF、TGF-β、FGF是三種信號通路，可以促進間質(zhì)干細胞的生長分化，如果其中之一受到抑制作用會影響間質(zhì)干細胞的生長，如果三種信號通路結(jié)合好，則會使間質(zhì)干細胞在培養(yǎng)基中傳到五代。如果無血清培養(yǎng)基鈣濃度較低，下調(diào)Smad蛋白介導(dǎo)會維持角膜基質(zhì)細胞的表型，角膜的上皮細胞也可以長期進行傳代培養(yǎng)。中草藥是我國的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)代表，細胞無血清培養(yǎng)技術(shù)也影響到中草藥的作用機制，研究顯示黃芪可以增加人皮膚表皮干細胞將粒酶轉(zhuǎn)化為錄酶，并增強其活性。

2.3 無血清培養(yǎng)基在細胞和組織移植中的應(yīng)用

無血清培養(yǎng)體系安全性較高，所以廣泛應(yīng)用于基于生物細胞培養(yǎng)的細胞或組織移植治療中。在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細胞，可以獲得與含血清培養(yǎng)基相同的增殖效果，如果患者屬于特殊貧血類型并且體重較輕，可以誘導(dǎo)人體成骨，并可以抑制異位骨，這方面比含血清培養(yǎng)更具有優(yōu)勢。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞，可以在無血清培養(yǎng)的條件下抑制細胞的凋亡，使骨髓間充質(zhì)干細胞可以存活于下肢缺血性疾病的治療中。

如果某些細胞和組織具移植的可能性，如果研制的培養(yǎng)基可以長久的維持細胞特性，這將會促進移植的成功率。新鮮剛分離的肝細胞具有特有的分化屬性，此屬性如果存在于含血清培養(yǎng)基中就會喪失掉，如果在無血清培養(yǎng)基中添加地塞米松、表皮生長因子、垂體提取物等，肝細胞就會保持3-4周的分化屬性，這對于需要肝部移植的患者來說，是一大福音。對由幼年牛軟骨外植體組成的無血清培養(yǎng)基進行觀察后發(fā)現(xiàn)，外植體的力學(xué)性能和生物含量得到了有效的加強，其性能一直比較穩(wěn)定，細胞充滿活力。含血清基外植體的力學(xué)則有所下降，并且損失了一定的聚糖并發(fā)。這充分說明了無血清培養(yǎng)基可以延長成熟細胞的特性，在組織互作無血清培養(yǎng)體系中，需要添加特定的材料來介導(dǎo)才能促進上皮間質(zhì)的互作。

2.4 無血清培養(yǎng)基在腫瘤治療方面的應(yīng)用

無血清培養(yǎng)基具有許多優(yōu)點，包括可以使細胞生存所需的營養(yǎng)物質(zhì)得到保證，除掉了血清中的促分化劑，對于腫瘤的發(fā)現(xiàn)和治療具有重要的應(yīng)用價值。無血清培養(yǎng)可以增加SP2/0細胞中的瘤細胞，這些瘤細胞都具有干細胞特性，可以將SP2/0中的腫瘤干細胞進行富集。細胞外基質(zhì)可以影響腫瘤細胞的存活、增殖和遷移，無血清培養(yǎng)基中加入纖維連接蛋白后來培養(yǎng)人乳腺癌細胞，可以上調(diào)基質(zhì) 金屬蛋白酶的活性。單克隆抗體可以阻斷整合素，可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活化反應(yīng)。在進行腫瘤治療時，對體外誘導(dǎo)擴增CIK細胞及抗腫瘤活性進行研究，分別采用無血清培養(yǎng)和含血清培養(yǎng)基，結(jié)果顯示無血清培養(yǎng)基可以代替含血清培養(yǎng)基，某些方面還有含血清培養(yǎng)沒有的優(yōu)勢。研究人員研究了適合于B16黑色毒瘤細胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，對樹突狀細胞進行預(yù)防。這說明無血清培養(yǎng)的免疫活性細胞可以用于腫瘤的生物免疫治療。

2.5 無血清培養(yǎng)基在外周血淋巴細胞抑制中的應(yīng)用

抑制外周血淋巴細胞的無血清培養(yǎng)基是一種生物制劑，主要成分是凝集素、基礎(chǔ)培養(yǎng)基和血清替代物，其血清替代物包括牛血清白蛋白、重組人胰島素、檸檬酸鐵和氨基酸母液，外周血淋巴細胞培養(yǎng)基不用動物或者人的血清，不僅降低了培養(yǎng)基成本，還可以降低疾病的傳播，此淋巴細胞培養(yǎng)基可以增強淋巴細胞的轉(zhuǎn)換率，促進淋巴細胞的分裂，抑制效果顯著，可以廣泛用于染色體核型的臨床診斷，是康復(fù)率低的淋巴疾病的福音。

3 小結(jié)

無血清培養(yǎng)體系具有含血清培養(yǎng)體系無法達到的優(yōu)勢，但需要在培養(yǎng)通用性、生產(chǎn)高效性以及成本和安全方面進行改進，未來隨著對細胞營養(yǎng)、細胞代謝 、細胞凋亡以及外源蛋白表達等的不斷研究，采用更多的科學(xué)實驗方法，可以使無血清培養(yǎng)基的開發(fā)更加快捷，使模擬細胞微環(huán)境的無血清培養(yǎng)體系可以廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)領(lǐng)域，特別是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，為更多的疑難雜癥以及再生性疾病提供更多的服務(wù)。

參考文獻

[1] 董書偉，馮秀亮等. 昆明小鼠原始生殖細胞無血清培養(yǎng)基的篩選，西北農(nóng)林科技大學(xué)出版社，2008，36（4）：27-31.

生物細胞的培養(yǎng)范文第4篇

[關(guān)鍵詞]涉外警務(wù)專業(yè)學(xué)生 出入境管理工作 情報信息應(yīng)用能力 培養(yǎng)

伴隨著21世紀的到來， 世界范圍內(nèi)的科技革命突飛猛進，數(shù)字化、智能化、網(wǎng)絡(luò)化等各種高新技術(shù)正向各個領(lǐng)域全方位滲透，警務(wù)方式也發(fā)生了革命性的變革，情報主導(dǎo)警務(wù)模式便成為當前警務(wù)工作方式的主流。面對新型警務(wù)模式的建立，出入境管理部門必須主動適應(yīng)信息化社會的客觀要求，牢固樹立情報信息主導(dǎo)警務(wù)的觀念，切實增強出入境情報信息管理工作的針對性、有效性和預(yù)見性，推動出入境管理工作的全面和可持續(xù)發(fā)展。

一、加強涉外警務(wù)專業(yè)學(xué)生情報信息應(yīng)用能力的培養(yǎng)是為從事出入境管理工作墊定基礎(chǔ)。

（一）情報信息的應(yīng)用是出入境管理工作中的中端業(yè)務(wù)。

出入境管理部門作為一個涉外的、公開實施行政管理的部門， 主要是代表國家行使出入境管理職能， 不僅其自身業(yè)務(wù)的發(fā)展和提高離不開情報信息工作， 而且出入境管理部門還必須通過開展和加強情報信息工作，為建設(shè)公安信息化隊伍的整體工作服務(wù)。

（二）當前出入境管理工作中情報信息應(yīng)用存在的問題。

1.出入境管理部門中公安民警的情報素質(zhì)相對較低具體表現(xiàn)在以下幾個方面：（1）公安民警對出入境情報信息收集工作的認識不夠， 在思想上還停留在單純以上報數(shù)量或獲取名次來衡量工作成績的傾向。（2）公安民警發(fā)現(xiàn)情報信息的敏感性不足，缺乏一名合格情報人員對情報信息所應(yīng)具有的職業(yè)敏感性。（3）公安民警收集情報信息的方法不得當，對于情報信息的收集僅僅停留在直接獲取的層次，而對于間接收集情報信息的方法沒有做深入研究。

2.情報信息在出入境管理工作中沒有得到全面發(fā)揮。由于出入境管理部門中公安民警的情報素質(zhì)相對較低，對于公安情報信息系統(tǒng)的使用也不夠熟悉，一些建立得較為完善的信息系統(tǒng)，大多還停留在資料庫、數(shù)據(jù)庫的利用上，只發(fā)揮出有限的查詢功能，系統(tǒng)更高級的功能沒有得到發(fā)揮。這是致使情報信息在出入境管理工作中沒有得到全面發(fā)揮的主要原因。

3.出入境管理部門的公安民警在情報信息應(yīng)用方面的培訓(xùn)與實戰(zhàn)脫軌。出入境管理部門十分重視情報信息在其工作的重要作用，也經(jīng)常給內(nèi)部民警做業(yè)務(wù)培訓(xùn)。問題的關(guān)鍵是培訓(xùn)的內(nèi)容針對性不強，只是圍繞公安系統(tǒng)的大框架介紹情報信息的應(yīng)用，而沒有針對出入境管理工作中情報信息的應(yīng)用展開分析。導(dǎo)致公安民警所學(xué)知識與實戰(zhàn)脫軌，無法適應(yīng)實戰(zhàn)。

（三）加強涉外警務(wù)專業(yè)學(xué)生情報信息應(yīng)用能力的重要性。

當前，出入境管理部門情報信息工作面臨的嚴峻形勢要求公安院校必須加強涉外警務(wù)專業(yè)學(xué)生情報信息工作能力的培養(yǎng)。作為涉外警務(wù)專業(yè)學(xué)生，我們肩負著維護祖國出入境管理秩序，保衛(wèi)祖國邊防安寧的神圣使命，因此必須要樹立正確的世界觀、價值觀、人生觀，努力提升自己，以適應(yīng)社會的需求，適應(yīng)出入境管理工作對出入境人才的需求。

二、涉外警務(wù)專業(yè)學(xué)生在出入境管理工作中情報信息應(yīng)用能力的培養(yǎng)目標。

（一）培養(yǎng)學(xué)生學(xué)習(xí)情報信息的積極興趣。

1.大力給學(xué)生貫徹情報主導(dǎo)警務(wù)的理念，讓學(xué)生認識到情報信息應(yīng)用能力在出入境管理工作中的重要意義。教師在平日的教學(xué)中要讓學(xué)生認識到情報信息是出入境管理工作的生命線，是科學(xué)決策的基礎(chǔ)，及時、準確、適用的情報信息是出入境管理部門克敵制勝的法寶。當情報主導(dǎo)警務(wù)的理念深入學(xué)生心中時，他們學(xué)習(xí)情報信息的興趣也會有很大的提高?！傲己玫拈_端是成功的一半”，只要激發(fā)出了學(xué)生學(xué)習(xí)情報信息的興趣，就能將他們培養(yǎng)出他們在出入境管理工作中情報信息應(yīng)用能力。

2.促成學(xué)生研究情報信息知識的主觀能動性，讓學(xué)生形成主動在出入境管理工作中應(yīng)用情報信息的潛意識。學(xué)習(xí)情報信息知識的特點在于易學(xué)難精，所以對學(xué)生而言，只有學(xué)習(xí)情報信息知識的一腔熱血是遠遠不夠的，最重要的是要有研究情報信息知識的主觀能動性。自覺地在情報信息知識的領(lǐng)域內(nèi)鉆研，領(lǐng)會情報信息知識的精華所在，自如的將情報信息應(yīng)用到出入境管理中去，形成一種在出入境管理工作中應(yīng)用情報信息的潛意識，提升自身在出入境管理工作中情報信息應(yīng)用的能力。

（二）培養(yǎng)學(xué)生在出入境管理工作中情報信息的收集能力和判斷能力。

1.提醒學(xué)生多留意出入境管理各方面的信息資源，讓學(xué)生養(yǎng)成積極捕捉情報信息的好習(xí)慣。“凡事預(yù)則立，不預(yù)則廢”，情報信息工作能力的形成是一個漫長而艱巨的過程，在這期間需要大量的情報信息的積累。因此教師在平日的學(xué)習(xí)生活中要提醒學(xué)生多留意出入境管理各方面的信息資源，讓學(xué)生養(yǎng)成積極捕捉情報信息的好習(xí)慣?！笆朗露疵鹘閷W(xué)問，人情練達介文章”，通過大量信息情報的積累，學(xué)生的思維無意識就會向情報信息方面靠攏。當這種思維過程已經(jīng)成為習(xí)慣性模式嵌入意識深處，變?yōu)橐环N自覺心理傾向，情報意識也就形成了。

2.增強學(xué)生對出入境情報信息的職業(yè)敏感性，讓學(xué)生形成敏銳的情報判斷能力。出入境情報信息工作做為一項特殊行業(yè)的工作，欲將其做好，必須增強對情報信息的職業(yè)敏感性，形成敏銳的情報判斷能力。對于情報判斷能力的提高需從兩個方面著手：一是對相關(guān)信息進行初步的分析研判， 防止大量信息垃圾的污染， 提高情報的收集效率。二是對情報進行系統(tǒng)的分析， 各方面信息綜合考慮， 相互比對、印證， 這樣能夠保證情報分析研判工作的準確性， 實現(xiàn)情報的優(yōu)勢。

（三）培養(yǎng)學(xué)生出入境管理工作中情報信息應(yīng)用的創(chuàng)造性。

1.豐富學(xué)生在出入境情報信息方面的知識，讓學(xué)生在出入境情報信息方面的思維得到擴展。情報信息方面的知識不是一成不變的，是不斷更新的，其更新周期的不斷縮短就要求我們不斷更新知識。教師應(yīng)著力豐富學(xué)生在出入境情報信息方面的知識，增強學(xué)生出入境情報信息知識需求意識，提高他們的檢索技能，通過大量的出入境情報信息知識的積累，使學(xué)生在出入境情報信息方面的思維得到擴展。

2.肯定學(xué)生在出入境情報信息領(lǐng)域內(nèi)的想象力，讓學(xué)生在出入境情報信息應(yīng)用之中添加自己的創(chuàng)新之處。出入境情報領(lǐng)域是一個沒有邊界的領(lǐng)域，在沒有邊界的學(xué)科研究中就不能否認學(xué)生獨到的見解之處。就出入境情報信息應(yīng)用而言，學(xué)生往往會想出很多新的方法將情報信息更好的銜接在出入境管理工作之中。此時，作為教師就應(yīng)該肯定學(xué)生在出入境情報信息領(lǐng)域的想象力，讓其在以后的工作中發(fā)揮更大的創(chuàng)造力。

三、涉外警務(wù)專業(yè)學(xué)生在出入境管理工作中情報信息應(yīng)用能力的培養(yǎng)途徑。

（一）加強涉外警務(wù)系教師情報主導(dǎo)警務(wù)的理念，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)情報信息的興趣。

出入境情報信息工作是一項實踐性很強的工作，學(xué)生欲想了解其中的技巧性，僅僅通過聆聽缺乏實戰(zhàn)經(jīng)驗的教師講述理論知識是遠遠不夠的。因此公安院校必須邀請長期從事出入境情報信息工作的民警來學(xué)校給教師和學(xué)生授課、作講座，介紹出入境管理中情報信息工作的經(jīng)驗與做法。同時選派涉外警務(wù)系的教師到出入境管理部門掛職鍛煉，增強出入境情報信息工作實踐經(jīng)驗，提升教師隊伍的素質(zhì)和授課水平。教師要積極關(guān)注國內(nèi)外有關(guān)出入境情報信息工作的最新動態(tài)，了解出入境管理工作中情報信息應(yīng)用的最新方法，及時傳遞給學(xué)生，活躍學(xué)生思維，激發(fā)他們學(xué)習(xí)情報信息的興趣，培養(yǎng)他們出入境情報信息應(yīng)用意識，提高他們在出入境管理工作中情報信息應(yīng)用的能力。

（二）加強學(xué)生在出入境管理工作中情報信息實際應(yīng)用能力，讓其在實踐工作之中提升自身情報信息的收集能力和判斷能力。

出入境信息工作極具實踐性的特性要求學(xué)生必須具有實際應(yīng)用能力。教育與實踐相結(jié)合是提高情報信息應(yīng)用能力的根本方法，因此校方應(yīng)該加強學(xué)生在出入境管理工作中情報信息實際應(yīng)用能力，盡可能多的讓學(xué)生到出入境管理部門進行實習(xí)工作，更多的接觸出入境管理工作中情報信息方面的知識。學(xué)生要積極利用見習(xí)和實習(xí)的機會，把在學(xué)校所學(xué)的有關(guān)出入境情報信息工作的理論運用到實際出入境管理工作中，在實踐工作中提升自身情報信息的收集能力和判斷能力。

（三）拓寬學(xué)生在出入境情報信息領(lǐng)域之中的知識面，努力開發(fā)其在出入境情報信息應(yīng)用之中的創(chuàng)新潛能。

出入境情報信息領(lǐng)域所涉及的知識十分廣闊，并且知識的更新周期也日漸縮短。因此教師應(yīng)該盡可能多收集國內(nèi)外有關(guān)情報信息的書籍，開拓情報信息工作的思路。同時應(yīng)該通過講座、培訓(xùn)的形式給學(xué)生講授與出入境情報信息有關(guān)聯(lián)的學(xué)科的基礎(chǔ)知識，特別要重點講授手工檢索、國際聯(lián)機檢索等知識，使學(xué)生盡早掌握常用的中外檢索工具的使用方法，接觸到出入境情報信息領(lǐng)域內(nèi)的更多更新的知識。學(xué)生通過研究出入境情報信息方面的知識，得出自己在出入境情報信息工作上的獨到見解，努力開發(fā)自身在出入境情報信息應(yīng)用中的創(chuàng)新潛能。

四、結(jié)語

總而言之， 在情報主導(dǎo)出入境管理工作的體系下公安教育也應(yīng)與時俱進， 注重涉外警務(wù)專業(yè)學(xué)生在出入境管理工作中情報信息應(yīng)用能力的培養(yǎng)，使學(xué)生畢業(yè)后適應(yīng)情報主導(dǎo)出入境管理體系下的工作要求，推進出入境管理工作信息化的建設(shè)。

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生物細胞的培養(yǎng)范文第5篇

關(guān)鍵詞：半夏；懸浮細胞；生物堿；茉莉酸甲酯；水楊酸

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.021

中圖分類號：R282.6 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）01-0087-04

Effects of Abiotic Elicitors MeJA and SA on Alkaloids Accumulation and Related Enzymes Metabolism in Pinellia ternata Suspension Cell Cultures DUAN Yong-bo， LU Fang， CUI Ting-ting， ZHAO Feng-lan， TENG Jing-tong， SHENG Wei， ZHANG Ai-min， XUE Jian-ping （Key Laboratory of Resource Plant Biology of Anhui Province， College of Life Sciences， Huaibei Normal University， Huaibei 235000， China）

Abstract： Objective To study the effects of abiotic elicitors methyl jasmonate （MeJA） and salicylic acid （SA） on the alkaloids accumulation and related enzymes metabolism in Pinellia ternata suspension cell cultures. Methods Using the leaf petioles-derived suspension cell cultures as the study object， the culture duration， concentrations of MeJA and SA were determined to get the optimal alkaloids accumulation， and the activities of metabolic enzymes IMP dehydrogenase and sAMP synthase were also measured. Results A 9-fold of dried biomass and a 3-fold of alkaloids accumulation were observed in P. ternata suspension cell cultures after culture for 21 d. Both MeJA and SA could significantly promote the accumulation of alkaloids in P. ternata suspension cells. 150 ?mol/L MeJA enhanced alkaloids content （4.7 mg/g DW） by 3.6 folds in comparison with control group， whereas 50 ?mol/L SA showed a 2.5-fold increase. Meanwhile， 100 ?mol/L MeJA and 50 ?mol/L SA promoted the increase in IMP dehydrogenase activity by 3.0 and 3.7 fold respectively， and 150 ?mol/L MeJA and 100 ?mol/L SA showed the increase by 2.6 and 4.4 fold respectively. Conclusion Proper adding exogenous MeJA and SA can promote the accumulation of alkaloids in Pinellia ternata suspension cell cultures.

Key words： Pinellia ternata； suspension cell cultures； alkaloids； methyl jasmonate； salicylic acid

半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.為天南星科

基金項目：國家自然科學(xué)基金（31501368、81573518）；安徽省自然科學(xué)基金（1408085MC58、1608085MC52）；安徽高校省級自然科學(xué)研究項目（KJ2016B016、KJ2015ZD35）

通訊作者：薛建平，E-mail：

多年生草本植物，其藥用功效最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。半夏以塊莖入藥，具有燥濕化痰、止咳鎮(zhèn)痛的作用，已成為我國最常用的十大中藥之一[1]。半夏富含生物堿、β-谷甾醇、多糖、揮發(fā)性油等，其中生物堿被視為其主要活性成分[2]。在半夏生物堿中，胡蘆巴堿含量常被作為半夏質(zhì)量控制指示，肌苷則用作半夏的鑒別性成分[3-4]。

作為大宗中藥材，半夏年需求量達500～600萬kg，而野生和人工栽培產(chǎn)量僅能滿足1/3，市場缺口很大[5]。自然狀態(tài)下，半夏極少進行有性生殖，主要通過珠芽或塊莖進行營養(yǎng)繁殖，繁殖系數(shù)低[6]。長期過度采伐導(dǎo)致野生半夏資源瀕于枯竭，而人工栽培依然面臨高溫、干旱、病蟲害以及人工成本等多方面因素的影響，難以滿足半夏藥材的市場需求。

懸浮細胞可在人為控制條件下實現(xiàn)活成分的生產(chǎn)，為解決藥用植物資源不足和成本控制提供了新途徑[7]。茉莉酸甲酯（MeJA）和水楊酸（SA）為重要的信號分子[8]，常被用于植物次生代謝途徑研究。本研究以半夏懸浮細胞系為研究對象，考察外源MeJA和SA對生物堿合成和相關(guān)代謝酶活性的影響，以期為利用半夏懸浮細胞系生產(chǎn)生物堿提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；HJH-C2112C超凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；QHZ-98B全溫度光照震蕩培養(yǎng)箱，太倉市華美生化儀器廠；BSA224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；752紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；GZX-9240MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；KQ-500超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH 5.4）、氯仿及溴麝草酚藍標準溶液，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、6-糠氨基嘌呤（KT）、茉莉酸甲酯（MeJA）、水楊酸（SA）及鹽酸麻黃堿等試劑均為Sigma-Aldrich產(chǎn)品。試驗所用半夏植株采自淮北市龍脊山自然風(fēng)景區(qū)（E-116°23′，N-34°14′），經(jīng)薛建平教授鑒定為宿半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit。

2 方法與結(jié)果

2.1 半夏懸浮細胞體系構(gòu)建

半夏愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+3%蔗糖+2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L KT+0.65%瓊脂，pH 5.8；細胞懸浮培養(yǎng)基為MS+3%蔗糖+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D，pH 5.8[9]。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為25 ℃黑暗培養(yǎng)；懸浮細胞培養(yǎng)條件為（23±1）℃，光照周期為14 h/10 h光暗交替，光照強度為3000 lx。

取半夏葉柄置于0.1%氯化汞浸泡6 min，無菌水潤洗5次后剪成約1.0 cm長段，接種至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，于25 ℃黑暗培養(yǎng)。3周后獲得愈傷組織，將所獲愈傷組織繼代培養(yǎng)3～5次。選取質(zhì)地松脆的顆粒狀愈傷接種至液體培養(yǎng)基進行懸浮培養(yǎng)（100 r/min），每15 d更換新培養(yǎng)基，直至獲得穩(wěn)定細胞系。將所獲細胞系在8 ℃低溫處理24 h，然后于25 ℃恢復(fù)培養(yǎng)36 h使細胞周期同步。之后在23 ℃培養(yǎng)9 d使同步化細胞進入對數(shù)生長期，獲得半夏懸浮細胞系。

2.2 鹽酸麻黃堿標準曲線的繪制

精密稱取10 mg鹽酸麻黃堿對照品溶解于氯仿中，定容至50 mL，搖勻，得0.20 mg/mL鹽酸麻黃堿對照品溶液。精密吸取0、1、2、3、4、5 mL至分液漏斗內(nèi)，添加蒸餾水補至5 mL，分別精密加入5 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH 5.4）、10 mL氯仿及1 mL溴麝草酚藍標準溶液，充分振搖后靜置1 h，分取氯仿層，水層再用氯仿重復(fù)萃取2次，每次10 mL。合并氯仿層，60 ℃水浴回收至干，用氯仿溶解，定容至10 mL[10]。于414 nm波長處分別測定其吸光度。以鹽酸麻黃堿濃度（C）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標，求得標準曲線為A=0.062C-0.076 8，r2=0.996 0（n=5）。

2.3 生物堿含量測定

整個培養(yǎng)周期持續(xù)28 d，每隔7 d取樣，所獲樣品立即保存于-70 ℃冰箱供測試分析。將所收集懸浮細胞樣品于50 ℃干燥后研磨成粉。準確稱取0.1 g樣品粉末置于25 mL具塞試管中，加濃氨水0.5 mL潤濕，加氯仿10 mL后于4 ℃冷浸3 h；冰浴超聲提取1 h后過濾，殘渣以10 mL氯仿分3次（4、3、3 mL）洗滌；將濾液與洗液合并，回收氯仿至干，加入10 mL氯仿使其溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL分液漏斗中，精密加入5 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 5.4）和1 mL溴麝香草酚藍標準溶液，充分振搖后，靜置1 h。分取氯仿層，水層再用氯仿同法萃取2次，每次10 mL。合并氯仿層，回收至干，殘留物用氯仿溶解，置于10 mL容量瓶中，并用氯仿定容、搖勻，即得處理組溶液[11]。取待測溶液2.0 mL，用DU730 Beckman Coulter核酸蛋白分析儀測其吸光度，代入鹽酸麻黃堿標準曲線中，計算生物堿的含量。

2.4 培養(yǎng)時間對懸浮細胞系生物量和生物堿含量的影響

以半夏葉柄為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，進行液體懸浮培養(yǎng)，獲得半夏懸浮細胞系。隨著培養(yǎng)時間延長，懸浮細胞干重總體呈現(xiàn)增長趨勢，在21 d時細胞干重為培養(yǎng)前9倍，之后有所下降（見圖1）；生物堿含量在培養(yǎng)7 d內(nèi)含量較低，到14 d時顯著增加，21 d時最高，達到1.56 mg/g DW，之后生物堿含量開始降低（見圖2）。當培養(yǎng)時間超過28 d后，懸浮細胞會逐漸變?yōu)楹稚?，開始壞死。根據(jù)細胞生物量和生物堿含量測定結(jié)果，選擇21 d作為懸浮細胞培養(yǎng)時間。

2.5 茉莉酸甲酯和水楊酸對生物堿含量的影響

試驗用MeJA和SA濃度均為0、50、100、150、200 ?mol/L。MeJA處理對半夏懸浮細胞系生物堿含量有顯著影響。除50 ?mol/L處理外，所試其他MeJA濃度均顯著促進半夏生物堿合成。以150 ?mol/L MeJA處理組最高，達到4.7 mg/g DW。150 ?mol/L MeJA處理組的生物堿含量為對照組的3.6倍。在SA處理中，50和100 ?mol/L可顯著提高半夏懸浮細胞系中生物堿的合成，更高濃度的SA則能促進生物堿的累積。50 ?mol/L SA處理組生物堿含量最高，為對照組的2.5倍。結(jié)果見圖3。

2.6 茉莉酸甲酯和水楊酸對IMP脫氫酶和sAMP合成酶活性的影響

在添加不同濃度MeJA或SA培養(yǎng)21 d后，測定半夏懸浮細胞中IMP脫氫酶和sAMP合成酶活性。取不同濃度外源激素的半夏懸浮培養(yǎng)細胞各1.0 g置于預(yù)冷的研缽中，加提取介質(zhì)在冰浴中研磨勻漿，4 ℃、1000 r/min離心15 min，上清液為酶粗提取液。將上述酶提取液加入相應(yīng)的酶反應(yīng)液，每隔30 s讀取吸光度值。酶活性以比活力表示，定義為1 min內(nèi)1 mg蛋白所能引起的吸光度值變化的1000倍[5]。

添加MeJA或SA均對IMP脫氫酶活性有顯著影響。50～150 ?mol/L MeJA為對照組IMP脫氫酶活性2.6～3.1倍，當MeJA濃度增加至200 ?mol/L時，酶活性有所下降；50 ?mol/L SA處理對IMP脫氫酶活性影響最大，酶活性為對照組3.7倍，隨濃度增加酶活性逐漸下降。結(jié)果見圖4。

對于sAMP合成酶，50 ?mol/L MeJA對酶活性無顯著影響（P>0.05），而較高濃度的MeJA顯著提高酶活性（P

3 討論

生物堿為重要的次生代謝物，是許多藥用植物的主要活性成分。目前多種藥用植物細胞內(nèi)生物堿合成及代謝規(guī)律逐步得以揭示，對于研究這些植物的藥用成分意義重大[12]。在諸多研究模式中，懸浮細胞系的應(yīng)用極為廣泛[13-14]，因其可為藥用成分的生產(chǎn)提供另一途徑，有助于解決藥用植物產(chǎn)量的缺口，獲得更高質(zhì)量的產(chǎn)品，同時保護野生資源。

本研究以葉柄來源的愈傷組織建立半夏懸浮細胞系，考察不同培養(yǎng)時間、MeJA和SA濃度對細胞中生物堿含量的影響，并分析生物堿合成相關(guān)酶活性。

在懸浮培養(yǎng)21 d時，半夏懸浮細胞干重增加了9倍，懸浮細胞中生物堿總量為培養(yǎng)0 d時的3倍，與Zhao J等[15]報道長春花懸浮細胞培養(yǎng)增殖結(jié)果接近。生物堿作為一種重要的次生代謝產(chǎn)物，其合成通常在細胞培養(yǎng)后期進行。添加較低濃度MeJA或SA不會影響半夏懸浮細胞的增殖，這在麻花艽懸浮細胞培養(yǎng)中同樣得到驗證[16]。同時，培養(yǎng)3周左右通常需要更換新鮮培養(yǎng)基，以補充營養(yǎng)成分并減少壞死細胞對培養(yǎng)的影響。因此，確定懸浮細胞系培養(yǎng)時間為21 d用于不同誘導(dǎo)子對生物堿累積影響的研究。

MeJA或SA作為重要的誘導(dǎo)子已用于萜類化合物等生物堿的代謝研究[17]。本研究表明，MeJA或SA處理均能顯著促進生物堿在半夏懸浮細胞中累積。培養(yǎng)21 d后，150 ?mol/L MeJA處理組生物堿含量為對照組3.6倍，50 ?mol/L SA處理組懸浮細胞生物堿含量達到對照組的2.5倍。同時測定了生物堿中嘌呤核苷酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶IMP脫氫酶和sAMP合成酶活性的變化情況。添加MeJA或SA均能顯著提高二者的酶活性。100 ?mol/L MeJA、50 ?mol/L SA處理使IMP脫氫酶活性分別為對照組3.0、3.7倍，150 ?mol/L MeJA、100 ?mol/L SA處理使sAMP合成酶活性分別為對照組2.6、4.4倍。比較生物堿累積量及所測代謝酶活性變化情況發(fā)現(xiàn)，生物堿累積與所測代謝酶活性變化趨勢較一致，說明IMP脫氫酶及sAMP合成酶在半夏生物堿代謝中具有較為重要的作用。

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