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本文作者：王建國(guó)1,2許琴瑟1王權(quán)1熊良偉1陸宏達(dá)1封琦1朱云干1作者單位：1江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院2上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院

試驗(yàn)結(jié)果

1溫度對(duì)酚氧化酶活力的影響

不同溫度下克氏原螯蝦鰓組織po活力變化如圖1，血清PO活力變化如圖2。鰓組織PO活力大于血清PO，不同溫度下鰓組織和血清PO活力變化規(guī)律很相似。0～35℃內(nèi)PO活力均隨溫度上升逐漸增大，各溫度組鰓組織PO活力均存在顯著差異(P＜0.05)，其中血清PO活力除20℃與25℃和25℃與30℃無(wú)顯著差異外，其余各組間均有顯著性差異(P＜0.05)。35～45℃之間PO活力逐漸下降，但尚未達(dá)到顯著差異水平(P＞0.05)。當(dāng)溫度高于45℃時(shí)PO活力急劇下降，各組間存在顯著差異(P＜0.05)。溫度低于35℃時(shí)樣品對(duì)照組引起的吸光度值較小，高于40℃時(shí)吸光度迅速增大，影響測(cè)定結(jié)果。0℃冰水浴中PO仍具有一定活力，約為25℃時(shí)的31%，35℃時(shí)的24%。溫度低于35℃時(shí)底物對(duì)照組引起吸光度變化較小，35℃以上隨溫度升高吸光度逐漸升高，40℃開始吸光度顯著高于35℃以下溫度組(P＜0.05)，65℃時(shí)吸光度最高，為35℃時(shí)的16倍。說(shuō)明溫度過(guò)高時(shí)底物引起的吸光度變化會(huì)干擾PO測(cè)定。

2緩沖液pH對(duì)酚氧化酶活力的影響

在不同pH環(huán)境中鰓組織中PO活力變化如圖3。鰓組織中PO在pH5.5時(shí)活力最高，除與pH6無(wú)顯著差異外(P＞0.05)，均顯著高于其它組(P＜0.05);pH6時(shí)與pH7～10各組間均存在顯著性差異(P＜0.05)。PO具活力的pH范圍為4～9.5，最適pH為5.5～6。結(jié)果顯示偏酸性緩沖液中PO活力較高。不同pH環(huán)境中血清中PO活力變化如圖4。血清中PO活力在pH6.5時(shí)最高，顯著高于其它組(P＜0.05)。具活力的pH范圍為5.5～8.5，pH為5.5～6和7～8各組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，pH低于5和高于9時(shí)活力迅速下降。pH5以下時(shí)樣品引起吸光度變化較大，pH越低吸光度變化越明顯;pH8.5以上時(shí)底物L(fēng)-DOPA會(huì)生成紅棕色物質(zhì)，pH越大越明顯，對(duì)測(cè)定干擾較大。以上結(jié)果說(shuō)明pH對(duì)血清PO和鰓組織PO的影響存在一定差異。

討論

1溫度對(duì)酚氧化酶活力的影響

日本對(duì)蝦［10］、日本［11］等酚氧化酶與L-DOPA反應(yīng)的最適溫度為40℃，白對(duì)蝦和斑節(jié)對(duì)蝦［12］最適溫度為45℃，南美白對(duì)蝦［13］最適溫度為50℃，中國(guó)對(duì)蝦［5］最適溫度為55℃，龍蝦［14］的最適溫度為30℃，鋸緣青蟹［15］最適溫度為25℃，朱毅菲等［7］報(bào)道克氏原螯蝦最適溫度為20℃。從以上數(shù)據(jù)可以看出甲殼動(dòng)物種類不同其PO最適溫度具有較大差異，在20～55℃之間不等，因此在進(jìn)行PO活力測(cè)定中根據(jù)品種選用合適的溫度條件是非常必要的。在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的溫度范圍(0～75℃)內(nèi)，克氏原螯蝦血清和鰓組織中PO的最適溫度均為35℃，朱毅菲等［7］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中溫度從20～50℃PO活力是呈下降趨勢(shì)，最適溫度為20℃，這兩個(gè)結(jié)果差異很大。但其未設(shè)置溫度低于20℃的情況，70淡水漁業(yè)2012年在20℃以下PO活力不清楚的情況下判斷最適溫度為20℃是不嚴(yán)密的。本實(shí)驗(yàn)所采用的克氏原螯蝦也是暫養(yǎng)在20℃左右，與朱毅菲等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異較大。朱毅菲等［7］認(rèn)為克氏原螯蝦血清PO活力在20℃最高的原因是實(shí)驗(yàn)用蝦處于22℃的水中已適應(yīng)了此溫度環(huán)境，在越接近其生活環(huán)境的溫度下酶活力越高，反應(yīng)越徹底;而反應(yīng)溫度與螯蝦環(huán)境溫度差異越大，對(duì)酚氧化酶造成的破壞越大。日本沼蝦［4］、日本對(duì)蝦［10］、南美白對(duì)蝦［13］、中國(guó)對(duì)蝦［5］等多種甲殼動(dòng)物PO最適溫度都高于其生活溫度，克氏原螯蝦適應(yīng)能力極強(qiáng)，在10～30℃能正常生長(zhǎng)發(fā)育，因而僅以適應(yīng)了實(shí)驗(yàn)溫度解釋其最適溫度是不可取的。另外朱毅菲等［7］的結(jié)果顯示當(dāng)溫度達(dá)到50℃以上時(shí)PO活力會(huì)出現(xiàn)升高的現(xiàn)象，其實(shí)不是活力真正升高，而是因?yàn)楫?dāng)溫度升高時(shí)樣品和底物均會(huì)產(chǎn)生較大吸光度所致(如圖1，2)，所以如果沒(méi)有設(shè)置空白對(duì)照扣除這部分差值就會(huì)得出50℃以上活力反而升高的結(jié)果，因此朱毅菲等［7］計(jì)算PO活力的方法也存在不妥之處。筆者認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)所得出的克氏原螯蝦酚氧化酶最適溫度為35℃可靠性更高，而朱毅菲等通過(guò)試驗(yàn)得出最適溫度為20℃的結(jié)果是不夠準(zhǔn)確的，一方面可能是由于試驗(yàn)本身造成，另一方面可能和所選實(shí)驗(yàn)對(duì)象的生活環(huán)境及地區(qū)差異等有關(guān)造成。本實(shí)驗(yàn)還測(cè)定了冰水混合物(0℃)時(shí)鰓組織和血清中PO的活力均為最高值的24%左右。許多學(xué)者在測(cè)定PO活力時(shí)均借鑒其他酶活力的測(cè)定工藝，使底物與樣品反應(yīng)一段時(shí)間后采用冰浴法來(lái)終止反應(yīng)［5-6］，這在克氏原螯蝦PO活力的測(cè)定中是有不妥之處的。冰浴只能在一定程度上減緩反應(yīng)速度，無(wú)法達(dá)到和其他酶同等的效果，因此該方法的使用有待學(xué)者斟酌。

2緩沖液pH值對(duì)酚氧化酶活力的影響

動(dòng)物體液的pH因種類不同而有一定差異，不同甲殼動(dòng)物PO最適pH也不完全相同。汪小鋒等［16］報(bào)道中國(guó)對(duì)蝦最適pH為6.0，楊玲玲等［11］報(bào)道日本最適pH為6.0，夏棟等［14］報(bào)道龍蝦最適pH為6.3，趙丙辰等［13］報(bào)道南美白對(duì)蝦最適pH為6.0，而陳麗嬌等［17］報(bào)道南美白對(duì)蝦最適pH為7.0，趙嬌等［10］報(bào)道日本對(duì)蝦最適pH為6.5，陸宏達(dá)等［8］報(bào)道中華絨螯蟹最適pH為6.5，潘清清等［15］報(bào)道鋸緣青蟹最適pH為7.8，以上報(bào)道的經(jīng)濟(jì)甲殼類PO最適pH大多在6～8之間，一些昆蟲PO最適pH在5.0～9.5。本試驗(yàn)結(jié)果顯示克氏原螯蝦鰓組織PO最適pH為5.5，血清PO最適pH為6.5，與朱毅菲等［7］報(bào)道的血清酚氧化酶最適pH為7.0的結(jié)果基本相似?？耸显r和大部分甲殼動(dòng)物相似，在偏酸性的環(huán)境中PO活力相對(duì)較高。有學(xué)者認(rèn)為偏酸性的環(huán)境會(huì)影響一些生物的PO活力［18］，和許多甲殼動(dòng)物的研究結(jié)果不同，所以不同物種的PO特性具有較大差異。本實(shí)驗(yàn)得出的最適pH和朱毅菲等［7］的結(jié)果略有差異，趙丙辰和陳麗嬌報(bào)道的南美白對(duì)蝦最適pH也存在一定差異，說(shuō)明不同的生活環(huán)境及物種地區(qū)差異對(duì)PO特性也可能有影響。本實(shí)驗(yàn)得出鰓組織PO活力的最佳pH為5.5，血清為6.5，具有一定差異;鰓組織PO活力大于血清PO與其他實(shí)驗(yàn)中呈現(xiàn)的結(jié)果相似［8］，這說(shuō)明同一物種體內(nèi)不同部位的酚氧化酶不完全相同。甲殼動(dòng)物PO的最適溫度、pH及激活劑、抑制劑等生化性質(zhì)存在差異，其酚氧化酶基因也有一定差異，但都具有將酚氧化成醌的共同性質(zhì)［19］，所以PO生化特性受物種差異影響較大，不同物種和不同組織都不能一概而論，具體差異還有待更多學(xué)者深入探討。Pind等［20］報(bào)道在測(cè)定PO時(shí)要盡量中和環(huán)境中多余的OH－以減少其和底物L(fēng)-DOPA發(fā)生反應(yīng)引起吸光度造成測(cè)量誤差。本實(shí)驗(yàn)顯示樣品在pH值5～8.5的緩沖液中吸光度變化不大，L-DOPA在酸性和中性緩沖液中較穩(wěn)定，當(dāng)pH超過(guò)8.5時(shí)溶液會(huì)生成黃棕色物質(zhì)，出現(xiàn)較大吸光值，pH值越大引起吸光度變化也越大，會(huì)干擾測(cè)定。因此在PO活性測(cè)定中需要設(shè)置底物和樣品對(duì)照，才能使結(jié)果更加準(zhǔn)確。