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免疫磁分離技術(shù)具有簡單、快速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),與其它檢測方法(如電化學(xué)、PCR、ELISA等)聯(lián)用,已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞的分離提純、靶向釋藥、致病菌檢測等研究領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)中以滅活的AIVH5N1為檢測對象,首先在H5抗體表面偶聯(lián)生物素,使之與表面修飾鏈霉親和素的150nm磁珠結(jié)合,以實(shí)現(xiàn)對AIVH5N1的純化和富集。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,對純病毒樣品和雞的咽拭子樣品進(jìn)行了檢測。

1搖實(shí)驗(yàn)部分

1.1搖儀器與試劑

金叉指陣列微電極(中國科學(xué)院半導(dǎo)體研究所),指電極對數(shù)為25對,基底為石英片(3cm伊1cm),指電極的寬度和間距均為15滋m,厚度為0.2滋m,長度為3mm。鏈霉親和素修飾的納米磁珠(直徑150nm,美國R&D公司);生物素化試劑Sulfo鄄NHS鄄Biotin、透析卡(美國Pierce公司);KPL洗液(美國KPL公司),本實(shí)驗(yàn)中使用的測量溶液為KPL洗液按1頤200000稀釋而成;磷酸鹽緩沖液(PBS,美國Sigma公司),本實(shí)驗(yàn)中使用的PBS緩沖液濃度為10mmol/L,pH為7.4;牛血清蛋白(BSA,北京博翔興旺科技有限公司);無水乙醇(分析純,北京化工廠);NaOH、HCl(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);實(shí)驗(yàn)用水均由美國Millipore公司生產(chǎn)的Mill鄄Q制得(18.2M贅•cm)?？笻5亞型AIV單克隆抗體、滅活的AIVH5N1/H1/H9亞型病毒、滅活的新城疫病毒、健康雞的咽拭子皆由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院提供。實(shí)驗(yàn)中純病毒樣品采用PBS緩沖液按濃度梯度對原病毒溶液進(jìn)行稀釋;拭子樣品采用健康雞的咽拭子在PBS緩沖液中的浸出液按濃度梯度對原病毒溶液進(jìn)行稀釋。

1.2搖檢測原理及過程

本研究的實(shí)驗(yàn)過程(圖1)主要包括4個步驟:生物素化抗體、制備H5抗體包被的免疫磁珠、捕獲并分離目標(biāo)病毒、阻抗測量。Sulfo鄄NHS鄄Biotin可與蛋白質(zhì)鏈上的氨基形成穩(wěn)定的酰胺鍵,從而對H5抗體進(jìn)行標(biāo)記。通過生物素與鏈霉親和素之間的高度親和力,使標(biāo)記生物素的H5抗體與表面修飾鏈霉親和素的150nm磁珠結(jié)合,形成H5抗體包被的免疫磁珠。當(dāng)樣品中存在目標(biāo)病毒AIVH5N1時,免疫磁珠能夠捕獲H5N1病毒,形成磁珠鄄抗體鄄病毒復(fù)合物。該復(fù)合物在外加磁場作用下定向移動并吸附于管壁內(nèi)側(cè)后,移除廢液,從而實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)病毒與樣品中其它非目標(biāo)分析物的分離。對照品懸液在制備過程中使用PBS緩沖液替代病毒溶液,其它制備步驟與上述樣品懸液的制備步驟相同。采用叉指陣列微電極分別測量對照品和樣品的阻抗譜,通過兩者間的差值判斷樣品中是否含有H5N1病毒。

1.3搖實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1搖生物素化抗體搖

將3滋LSulfo鄄NHS鄄Biotin溶液(10mmol/L)和100滋LH5抗體溶液(1.5g/L)加入200滋LPBS緩沖液中,室溫下孵育1h,使生物素偶聯(lián)到H5抗體表面。然后用1mL注射器將其注入透析卡內(nèi),浸入PBS緩沖液于室溫下透析2h后,更換PBS緩沖液于室溫下繼續(xù)透析,經(jīng)過2h后,更換PBS緩沖液在4益下透析12h,以去除沒有偶聯(lián)到抗體上的過量的Sulfo鄄NHS鄄Biotin。最后,將偶聯(lián)生物素的抗體溶液從透析卡中移出,用PBS緩沖液將其稀釋1倍,置于4益環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2搖免疫磁分離搖

將25滋L表面修飾鏈霉親和素的150nm磁珠、50滋L生物素化的抗體溶液和100滋LPBS緩沖液加入經(jīng)1%BSA封閉的1.5mL離心管內(nèi),置于旋轉(zhuǎn)混合器中以15r/min的速度旋轉(zhuǎn)混合,利用生物素與鏈霉親和素之間的高度親和力,將H5抗體連接到150nm磁珠表面。旋轉(zhuǎn)混合30min后,將離心管置于磁分離器中進(jìn)行磁分離,移除廢液,即完成了免疫磁珠的制備。在免疫磁珠中加入200滋LPBS緩沖液為對照品,加入200滋L病毒溶液作為待測樣品,于室溫下旋轉(zhuǎn)混合,樣品中的目標(biāo)病毒與磁珠表面的抗體發(fā)生免疫結(jié)合后,采用磁分離器進(jìn)行磁分離并移除廢液。在對照品和樣品中均加入150滋L測量溶液,經(jīng)旋渦混合器混合10s后,即可直接進(jìn)行阻抗測量或于4益下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3搖電極清洗搖

將金叉指陣列微電極置于1mol/LNaOH、1mol/LHCl溶液中分別浸泡5min,然后用蘸有無水乙醇的擦鏡紙輕輕擦拭電極表面,超純水徹底沖洗后用氮?dú)獯蹈?即得到表面潔凈的金電極。

1.3.4搖阻抗測量搖

將25滋L對照品或樣品懸液直接滴加到潔凈的叉指陣列微電極表面進(jìn)行阻抗測量,測量頻率范圍為20Hz~1MHz,外加交流電壓幅值為50mV,記錄Bode阻抗譜(阻抗模值vs頻率)。

2搖結(jié)果與討論

2.1搖抗體濃度對阻抗信號的影響

研究了抗體濃度對阻抗信號大小的影響,阻抗信號定義為100kHz頻率下被測樣品與對照品阻抗模值的差值。先將免疫反應(yīng)時間固定為90min,磁分離時間固定為5min,以濃度為22HAunit/50滋L的純病毒懸液作為被測樣品。分別用0.025,0.05,0.125,0.25和0.5g/L抗體制備免疫磁珠,并進(jìn)行病毒分離和阻抗測量。由圖2可見,阻抗信號隨抗體濃度增加而增大,當(dāng)抗體濃度為0.25g/L時,阻抗信號達(dá)到最大值。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇的最佳抗體濃度為0.25g/L。

2.2搖免疫反應(yīng)時間對阻抗信號的影響

本實(shí)驗(yàn)研究了免疫反應(yīng)時間(20,30,50,60,90和120min)對阻抗信號的影響,實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件為:抗體濃度0.25g/L、磁分離時間5min、純病毒樣品濃度22HAunit/50滋L。結(jié)果如圖3所示,隨著免疫反應(yīng)時間的延長,阻抗信號不斷增大,當(dāng)免疫反應(yīng)時間超過60min后,阻抗信號隨反應(yīng)時間的增加變得緩慢。因此,考慮到盡量縮短測量時間,將免疫反應(yīng)時間定為60min。

2.3搖磁分離時間對阻抗信號的影響

在不同的磁分離時間(1,2,3,4和5min)下,測定阻抗信號的大小,實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件為:抗體濃度0.25g/L、免疫反應(yīng)時間60min、純病毒樣品濃度22HAunit/50滋L。結(jié)果表明,阻抗信號隨磁分離時間的延長而增大,3min后達(dá)到平衡,阻抗信號值基本保持不變。因此,本實(shí)驗(yàn)確定磁分離時間為3min。

2.4搖禽流感H5N1亞型病毒的檢測

在上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,測量了濃度(2-3~24HAunit/50滋L)純病毒樣品和拭子樣品的阻抗譜,結(jié)果如圖4所示。阻抗模值隨H5N1病毒濃度的增加而升高,樣品中AIVH5N1引起阻抗模值的差異在頻率100kHz處最為顯著,因此將100kHz確定為本實(shí)驗(yàn)的特征頻率。在特征頻率下,通過計(jì)算樣品與對照品的阻抗差值確定阻抗信號值,在相同條件下將每個濃度的病毒樣品重復(fù)制備并測量3次,計(jì)算阻抗信號的平均值,其標(biāo)準(zhǔn)差如圖5中誤差棒所示。當(dāng)純病毒樣品中H5N1病毒濃度在2-1~24HAunit/50滋L范圍內(nèi),阻抗信號值(吟Z)與病毒濃度(C)的對數(shù)值呈線性關(guān)系,線性回歸方程為吟Z=487.8log2C+1243.4(R2=0.9022),檢出限為0.5HAunit/50滋L;當(dāng)拭子樣品中H5N1病毒濃度在20~24HAunit/50滋L范圍內(nèi),阻抗信號值(吟Z)與病毒濃度(C)對數(shù)值的線性相關(guān)方程為吟Z=388.3log2C+389.8(R2=0.9273),檢出限為2HAunit/50滋L。

2.5搖特異性分析

采用免疫磁分離技術(shù)分別制備對照品、濃度為22HAunit/50滋L的AIVH1,H9和ND的純病毒樣品懸液,并測量其在特征頻率下的阻抗模值。非目標(biāo)病毒AIVH1,H9和ND均不會引起明顯的阻抗變化,此病毒檢測方法具有良好的特異性。

3結(jié)論

建立了免疫磁分離和阻抗測量技術(shù)檢測禽流感H5亞型病毒的方法,可快速、準(zhǔn)確地檢測純病毒樣品和雞的咽拭子樣品中的H5N1病毒。在特征頻率下分析樣品中不同濃度H5N1病毒引起的阻抗變化。對純病毒樣品和拭子樣品進(jìn)行檢測,檢出限分別為0.5和2HAunit/50滋L。本方法不僅靈敏度高、特異性好,而且操作簡便、檢測速度快,在病原微生物快速檢測領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

作者：顏小飛汪懋華溫新華安冬單位：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部現(xiàn)代精細(xì)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)集成研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室