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真核細胞范文第1篇

例1 關于同一個體中細胞有絲分裂和減數(shù)第一次分裂的敘述，正確的是（ ）

A.兩者前期染色體數(shù)目相同，染色體行為和DNA分子數(shù)目不同

B.兩者中期染色體數(shù)目不同，染色體行為和DNA分子數(shù)目相同

C.兩者后期染色體行為和數(shù)目不同，DNA分子數(shù)目相同

D.兩者后期染色體行為和數(shù)目相同，DNA分子數(shù)目不同

解析 有絲分裂和減數(shù)分裂分裂期過程的最大區(qū)別是染色體的行為不同。有絲分裂前期有同源染色體但不聯(lián)會，中期染色體的著絲點被紡錘絲拉到赤道板位置排列整齊，后期著絲點分裂，姐妹染色單體分離并分別移向細胞的兩極，此時染色體數(shù)目暫時性加倍，DNA分子數(shù)不變，分裂的結果是分裂前后染色體數(shù)與DNA分子數(shù)與分裂前一樣。減數(shù)第一次分裂前期同源染色體聯(lián)會，中期是聯(lián)會的同源染色體被拉到赤道板的兩側并列分布，后期同源染色體分離及非同源染色體的自由組合，分裂的結果是染色體數(shù)目和DNA 數(shù)目均減少一半。由于DNA是在間期復制的，在分裂期總數(shù)未增加。有絲分裂的前期無同源染色體聯(lián)會的行為，所以A、B、D錯。本題通過有絲分裂和減數(shù)第一次分裂中有關染色體行為和DNA數(shù)目變化規(guī)律的內(nèi)容，考查兩種分裂方式的相同點和不同點，考查大家對兩種分裂方式的識記和分析解決問題的能力。

答案 C

例2 判斷下列細胞正在進行什么分裂，處在什么時期？

解析 該題要求根據(jù)細胞分裂圖能判斷其所處的時期，實際上需要區(qū)分有絲分裂、減Ⅰ和減Ⅱ的前、中、后期的特點。前期特點：有絲分裂是核膜核仁消失，出現(xiàn)了紡錘體和染色體，染色體散亂排列；減Ⅰ是同源染色體配對聯(lián)會，出現(xiàn)四分體，交叉互換；減Ⅱ是非同源染色體散亂排列在細胞內(nèi)。中期特點：有絲分裂是染色體排列在赤道板上，染色體形態(tài)數(shù)目清晰；減Ⅰ是同源染色體排列在赤道板上；減Ⅱ是非同源染色體排列在赤道板上。后期特點：有絲分裂是著絲點分裂，姐妹染色單體分離變成染色體，染色體數(shù)目加倍；減Ⅰ是同源染色體分離，非同源染色體自由組合；減Ⅱ是著絲點分裂，姐妹染色單體分離變成染色體，染色體數(shù)目加倍。

答案 1. 減Ⅱ前期 2. 減Ⅰ前期 3. 減Ⅱ前期 4. 減Ⅱ末期 5. 有絲分裂后期 6. 減Ⅱ后期 7. 減Ⅱ后期 8. 減Ⅰ后期 9. 有絲分裂前期 10. 減Ⅱ中期 11. 減Ⅰ后期 12. 減Ⅱ中期 13. 減Ⅰ前期 14. 減Ⅱ后期 15. 減Ⅰ中期 16. 有絲分裂中期

點撥 可按下列步驟判斷：一看染色體數(shù)目，奇數(shù)為減Ⅱ（姐妹染色單體分家只看一極），偶數(shù)進行二看；二看有無同源染色體，沒有為減Ⅱ（姐妹染色單體分家只看一極），有同源染色體進行三看；三看同源染色體行為，根據(jù)同源染色體行為確定有絲分裂或減Ⅰ。

例3 下圖表示某種生物細胞核內(nèi)染色體及DNA相對量變化的曲線圖。根據(jù)此曲線圖回答下列問題：（注：橫坐標各個區(qū)域代表細胞分裂的各個時期，區(qū)域的大小和各個時期所需的時間不成比例）

（1）圖中代表染色體相對數(shù)量變化的曲線是 。

（2）形成配子時，成對的遺傳因子分離發(fā)生在圖中的 過程。

（3）細胞內(nèi)含有四分體的區(qū)間是 。

（4）若該生物體細胞中染色體數(shù)為20條，則一個細胞核中的DNA分子數(shù)在9—12時期為 條。

（5）著絲點分裂發(fā)生在橫坐標數(shù)字的 處進行。

解析 根據(jù)DNA和染色體在有絲分裂和減數(shù)分裂中的變化特點可知，曲線A為DNA的變化曲線，B為染色體的變化曲線。這個圖把減數(shù)分裂、受精作用和有絲分裂很好的聯(lián)系在一起。0～8表示的是減數(shù)分裂；8位點發(fā)生受精作用；8～13表示的是有絲分裂。具體的時間段1～2、2～3、3～4、4～5、5～6、6～7、7～8依次為減Ⅰ的前期、中期、后期、減Ⅱ的前期、中期后期和末期；9～10、10～11、11～12、12～13依次為有絲的前期、中期、后期和末期。成對的遺傳因子分離發(fā)生在減Ⅰ后期，即3～4；四分體形成于減Ⅰ前期，消失于減Ⅰ后期，存在區(qū)間即1～3；著絲點分裂是瞬間完成的，在兩個地方發(fā)生：減Ⅱ后期和有絲后期剛開始時，這里很多考生往往不是漏掉一個就是填成區(qū)間。

答案 （1）B （2）3～4 （3）1～3 （4）40 （5）6、11

點撥 主要是減數(shù)分裂染色體、DNA的變化和有絲分裂染色體、DNA的變化四種曲線的比較（如下圖）。

[減數(shù)分裂染色體的變化][減數(shù)分裂DNA的變化][① ②]

[③ ④] [有絲分裂DNA的變化][有絲分裂染色體的變化]

區(qū)別有絲分裂曲線與減數(shù)分裂曲線：看起點和終點，起點和終點在同一直線上的為有絲分裂；不在同一直線上的為減數(shù)分裂。（如圖①與圖②或圖③與圖④）

區(qū)別染色體曲線與DNA曲線：看染色體或DNA暫時加倍的時間，加倍的時間在間期，且線條是傾斜（DNA的復制需一定時間）的為DNA；加倍的時間在后期（有絲分裂后期或減數(shù)第二次分裂后期），且是突然加倍（著絲點的分裂是瞬間的）的為染色體。（如圖①與圖③或圖②與圖④）

1.a和b屬于同一動物體內(nèi)的兩個細胞，通過對其核內(nèi)DNA分子含量的測定，發(fā)現(xiàn)a細胞中DNA含量是b細胞的兩倍，最可能的解釋是（ ）

A.a是正常體細胞，b是處于減數(shù)第一次分裂結束時的細胞

B.a是處于有絲分裂后期的細胞，b是處于有絲分裂前期的細胞

C.a是處于有絲分裂前期的細胞，b是處于減數(shù)第一次分裂后期的細胞

D.a處于有絲分裂中心體相互分離時，b處于次級性母細胞中染色體移向兩極時

2.圖示某雄性二倍體動物體內(nèi)一個正在分裂的精原細胞。這個細胞所處的時期為（ ）

A.有絲分裂中期

B.減數(shù)第一次分裂中期

C.減數(shù)第二次分裂中期

D.減數(shù)第一次分裂間期

3.下圖表示某種植物生殖與發(fā)育過程中，細胞內(nèi)染色體和DNA相對含量的變化曲線，據(jù)圖回答下列問題。

（1）圖中“——”（實線）表示 含量的變化，“- - -”（虛線）表示 含量的變化。

（2）圖中表示有絲分裂的階段是 ，表示減數(shù)分裂的階段是 ，表示受精作用的點是 。

真核細胞范文第2篇

【摘要】

目的: 觀察CRLF3蛋白在293T細胞中的表達及亞細胞定位， 并在大腸桿菌中表達和純化了重組CRLF3蛋白。方法: 將真核表達載體pCMVmycCRLF3瞬時轉染293T細胞， 轉染24 h和48 h后免疫熒光染色， 共聚焦顯微鏡觀察蛋白表達及定位; 構建原核表達質(zhì)粒pGEX4T1CRLF3， 實現(xiàn)插入基因的融合表達， 經(jīng)GST親合層析純化蛋白。結果: CRLF3蛋白在293T細胞中高效表達， 主要分布在細胞質(zhì)和細胞膜; 成功構建了表達CRLF3融合蛋白的原核表達載體， 并在大腸桿菌內(nèi)高效表達， 純化后得到Mr 約為74000的融合蛋白。結論: 在真核細胞中過表達的CRLF3蛋白主要定位在細胞質(zhì)和細胞膜; 獲得了重組GSTCRLF3融合蛋白，為進一步探討CRLF3的功能奠定基礎。

【關鍵詞】 人細胞因子受體樣因子3 真核表達 原核表達 蛋白純化

[Abstract]AIM: Cytokine receptorlike factor 3 (CRLF3) is a novel gene cloned from K562 cell line. The aim of the current study is to observe CRLF3 expression and subcellular localization in 293T cells and to express and purify the CRLF3 fusion protein in E.coli. METHODS: The plasmid pCMVmycCRLF3 was transiently transfected into 293T cell. The expression and localization of CRLF3 protein was observed by immunostaining approach. CRLF3 was also cloned into pGEX4T1 vector. The GSTCRLF3 fusion protein was expressed in E.coli and purified by GST affinity chromatography． RESULTS: CRLF3 protein was highly expressed in transfected 293T cells. CRLF3 protein was distributed in both cytoplasm and cell membrane. The GSTCRLF3 fusion protein was expressed as a Mr 74 000 protein and then successfully purified from E.coli cells. CONCLUSION: Overexpressed CRLF3 is a cytoplasmic protein that distributes in both cytoplasm and cell membrane in mammalian cells. The recombinant GSTCRLF3 fusion protein had been isolated and could be used for further antibody production and functional characterization.

[Keywords]CRLF3; eukaryotic expression; prokaryotic expression; protein purification

人細胞因子受體樣因子3（cytokine receptorlike factor 3， CRLF3）是一個具有I類細胞因子受體保守功能域的新基因。本實驗室從K562細胞中克隆出CRLF3[1]， 并提交NCBI GenBank（DQ298450）。CRLF3基因編碼區(qū)全長1317 bp， 編碼一個438個氨基酸的蛋白質(zhì)。生物信息學分析CRLF3定位在17q11.2， 具有一個重要的結構域——FN3功能域， 這一結構域的C末端， 有一個RGD基序和I類細胞因子受體特有的WSXWS基序， CRLF3基因保守存在于多種生物中。對CRLF3的功能研究表明CRLF3 的過表達可以抑制細胞周期， 使細胞停滯在G0/G1期， 減少了進入S期的細胞， 其作用機制尚不明確。CRLF3可能是一種交通信號分子。本研究中， 我們將CRLF3基因在真核細胞中表達， 觀察了CRLF3在真核細胞中的定位， 并在原核細胞中表達和純化了其融合蛋白， 為進一步研究CRLF3的功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 真核表達質(zhì)粒pCMVmycCRLF3、 人胚腎293T細胞、 融合表達載體pGEX4T1、 E.coli DH5α、 E.coli BL21(DE3)均由本室保存; MEM、 胎牛血清購自Gibco公司; T4連接酶、 BamH I、 Xho I限制性內(nèi)切酶、 λEcoT14I digest DNA marker、 蛋白maker均購自TaKaRa公司; 磷酸鈣轉染試劑購自碧云天生物技術公司; cMyc抗體購自Santa Cruz公司; FITC標記山羊抗小鼠IgG購自中杉金橋公司; GSTTag抗體購自Proteintech公司; Glutathione Sepharose 4B購自GE Healthcare公司; PCR引物由上海英俊生物技術公司合成; 其他均為國產(chǎn)分析純生化試劑。

1.2 方法

1.2.1 293T細胞的培養(yǎng)和pCMVmycCRLF3的轉染 將生長狀態(tài)良好的293T細胞按1×105 cells/孔的密度轉移到放玻片的6孔板中， 在含100 mL/L胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。轉染前30 min， 換新鮮的培養(yǎng)液2 mL， 分別取5 μg空載體質(zhì)粒和pCMVmycCRLF3與磷酸鈣轉染試劑混勻， 室溫孵育20 min， 均勻滴加到6孔板內(nèi)， 在50 mL/LCO2， 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h和48 h。

1.2.2 免疫熒光染色 轉染24 h和48 h后， 棄去培養(yǎng)液， 多聚甲醛固定20 min， 5 mL/L TritonX100去膜10 min。含100 mL/L胎牛血清的PBS封閉1 h， 加入抗cmyc抗體（1∶100）室溫孵育1 h， PBST充分洗滌。加入FITC標記山羊抗小鼠IgG（1∶100）室溫孵育1～2 h， PBST充分洗滌。最后加入0.5 g/L DAPI(聯(lián)瞇基苯吲哚酸鹽)標記細胞核15min， 洗滌后500mL/L甘油封片， 共聚焦顯微鏡觀察結果。

1.2.3 pGEX4T1CRLF3融合表達載體的構建 以本室構建的pCMVmycCRLF3質(zhì)粒為模板， 根據(jù)已測得的CRLF3的全長序列設計引物， 進行PCR擴增。上游引物序列為5′TATA GGATCC ATG GAG CTG GAG CCT GAG CT3′， 其中導人BamH I酶切位點; 下游引物序列為5′TATA CTCGAG CTA AAA CAC TAA CAC TTT CC3′， 其中導人Xho I酶切位點。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳回收， BamH I和Xho I酶切pGEX4T1載體和PCR產(chǎn)物， T4連接酶連接， 轉化DH5α感受態(tài)細胞。挑取單個克隆于5 mL LB(Amp+)培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜， 提取重組質(zhì)粒， BamH I/Xho I酶切鑒定， 陽性克隆提交上海英俊生物技術公司進行測序分析。

1.2.4 GSTCRLF3融合蛋白的誘導表達和純化 將序列正確的重組表達質(zhì)粒pGEX4T1CRLF3轉化宿主菌BL21（DE3）， 挑選5個單個菌落分別接種到5 mL LB（Amp＋）管中， 與37℃劇烈搖動培養(yǎng)過夜。每個菌落的培養(yǎng)物按1/100的比例接種到2個新鮮LB（Amp＋）管中， 37℃劇烈搖動培養(yǎng)4 h， A550達到0.6～0.8后， 向其中一管中加入終濃度為1 mmol/L IPTG， 另一管為未誘導的對照菌， 30℃繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h。離心收集培養(yǎng)液各1 mL， 菌體沉淀以100 μL PBS重懸， 取10 μL樣品進行120 g/L SDSPAGE電泳， 考馬斯亮藍染色。以空載體轉化的大腸桿菌BL21(DE3)作為陰性對照， 檢測蛋白表達情況， 選出蛋白表達量高的菌落做種子。

1.2.5 融合蛋白的大量表達和純化 選取融合蛋白表達量高的種子菌， 以終濃度為1 mmol/L IPTG大量誘導菌液500 mL， 離心收集菌體， 1×PBS(pH7.4)懸浮菌體， 冰浴條件下超聲破裂菌體， 4℃、 120000 r/min離心30 min， 取少量上清和沉淀， 進行SDSPAGE檢測， 分析蛋白質(zhì)在胞內(nèi)表達形式。確定目的蛋白以可溶性形式存在后， 取超聲上清過裝有500 μL Glutathione Sepharose 4B凝膠的純化柱， 以1 L的PBS淋洗， 去除雜蛋白， 最后用1倍柱體積的GST洗脫緩沖液 (50 mmol/L TrisHC1 pH8.0， 10 mmol/L還原型谷胱甘肽)洗脫目的蛋白。

1.2.6 Western blot鑒定融合蛋白 取純化的蛋白進行120 g/L丙烯酰胺凝膠電泳， 電轉移至硝酸纖維素膜上， 50 g/L脫脂奶粉4℃封閉過夜。加入GST抗體（1∶2500）室溫孵育2 h， TBST充分洗滌， 加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（1∶5000）， 室溫孵育1 h， TBST充分洗滌， ECL顯影。

2 結果

2.1 共聚焦顯微鏡觀察結果 采用共聚焦顯微鏡觀察CRLF3蛋白在293T細胞中的表達及分布。以轉染pCMVmyc空載體的293T細胞為本底對照， 40倍物鏡下觀察可見CRLF3在真核細胞中高效表達。油鏡下觀察可見瞬時轉染24h后的CRLF3均勻分布在胞質(zhì)中; 瞬時轉染48 h后的CRLF3分布在細胞質(zhì)和細胞膜上（圖1）。

圖1 轉染24 h和48 h后免疫熒光染色（略）

Fig 1 Immunostaining of CRLF3 on 293T cell transfecting pCMVmycCRLF3 after 24 h and 48 h(×1000)

A: Antimyc after 24 h; B: DAPI; C: Merged; D: Antimyc after 48 h; E: DAPI; F: Merged.

2.2 重組質(zhì)粒的構建和鑒定 以pCMVmycCRLF3質(zhì)粒為模板擴增的產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳， 得到一條特異條帶， 與目的片段1318 bp的大小位置相符（圖2）。重組質(zhì)粒pGEX4T1CRLF3采用BamH I/Xho I酶切鑒定（圖3）， DNA測序分析， 證明插入序列是目的序列， 且與融合表達載體的讀碼框相符。

圖2 CRLF3 PCR擴增產(chǎn)物（略）

Fig 2 CRLF3 product of PCR

1: CRLF3 PCR product; 2: λEcoT14I digest DNA marker.

圖3 重組質(zhì)粒pGEX4T1CRLF3的酶切鑒定（略）

Fig 3 Restriction analysis of recombinant plasmid pGEX4T1CRLF3

1: λEcoT14I digest DNA marker; 2: pGEX4T1CRLF3 digested by BamH I and Xho I.

2.3 重組蛋白在大腸桿菌BL21中的表達和純化 SDSPAGE結果顯示， 轉化空載體的對照組BL21 IPTG誘導后， 在Mr 26000的位置上出現(xiàn)1條濃集帶; 轉化pGEX4T1CRLF3重組質(zhì)粒的BL21 IPTG誘導后， 在Mr約為74000的位置上出現(xiàn)1條較濃集而且表達量受IPTG誘導的蛋白條帶， 說明插人的融合基因已經(jīng)在大腸桿菌中表達， 但在這一位點上也有內(nèi)源性基因的表達。超聲破碎菌體并離心后， 分別取上清和沉淀進行SDSPAGE電泳檢測， 顯示目的蛋白主要在上清液中， 它在菌體內(nèi)主要以可溶性形式存在; 利用Glutathione Sepharose 4B親和純化目的蛋白， SDSPAGE分析得到1條Mr為74000的單一條帶?；叶葤呙璺治?， 純度達到85%（圖4）。

圖4 SDSPAGE分析融合蛋白的表達及純化（略）

Fig 4 SDSPAGE analysis of expression and purification of fusion protein

1: Protein maker; 2: pGEX4T1 transformed BL21（IPTG-）; 3: pGEX4T1 transformed BL21（IPTG＋）; 4: pGEX4T1CRLF3 transformed BL21（IPTG-）; 5: pGEX4T1CRLF3 transformed BL21（IPTG＋）; 6: Supernatant; 7: Sediment; 8: Purified fusion protein.

2.4 Western blot檢測 用抗GSTtag多克隆抗體對純化的GSTCRLF3融合蛋白進行Western blot檢測?？笹ST的抗體可以檢測到Mr為74000的CRLF3融合蛋白條帶， 提示純化后的蛋白為所需要的GST融合蛋白。

3 討論

CRLF3基因定位在17q11.2， 鄰近NF1 (neurofibromatosis type 1)基因， 在神經(jīng)纖維瘤患者中， CRLF3基因常與NF1一起缺失。神經(jīng)纖維瘤的遺傳學致病機制是由于NF1基因的微缺失， 其缺失的范圍至少包括11個基因， CRLF3為其中之一[2， 3]。NF1基因是一種抑癌基因[4]， 而缺失基因簇中的其他基因功能尚不清楚。對CRLF3的生物信息學預測， 它不具有跨膜結構域， 沒有核定位信號與細胞器定位信號， 是一種胞質(zhì)蛋白質(zhì)。本研究中通過在真核細胞中表達CRLF3， 可見CRLF3轉染24 h后主要定位在細胞質(zhì)， 轉染48 h后， 則在細胞質(zhì)和細胞膜上均有分布， 提示在真核細胞中過表達的CRLF3是一種胞質(zhì)蛋白質(zhì)， 充分表達后向細胞膜遷移。CRLF3含有FN3功能域和RGD基序， 含有這樣結構域的分子大部分具有介導細胞間黏附和相互作用的功能， 而且主要以受體和分泌形式存在[5]。具有RGD基序的胞質(zhì)蛋白CRLF3是否也具有介導細胞間黏附和相互作用的功能， 或在細胞質(zhì)中發(fā)揮通訊分子的作用，有待進一步探討。

本研究中， 我們利用可誘導表達的大腸桿菌表達系統(tǒng)， 以原核表達質(zhì)粒pGEX4T1為載體表達出GSTCRLF3的融合蛋白， 進一步應用GST親和層析法有效分離得到純化的目的基因CRLF3的融合蛋白[6]， 為下一步制備抗CRLF3的多克隆抗體， 更好的研究CRLF3的功能創(chuàng)造條件。

參考文獻

[1] Yang F， Zhang Y， Cao YL， et al. Establishment and utilization of a tetracyclinecontrolled inducible RNA interfering system to repress gene expression in chronic myelogenous leukemia cells[J]. Acta Biochim Biophys Sin， 2005， 37(12): 851-856.

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真核細胞范文第3篇

【關鍵詞】  α突觸核蛋白;質(zhì)粒;帕金森病

【摘要】  目的 構建攜帶人alpha突觸核蛋白真核重組質(zhì)粒，檢測其在人神經(jīng)母細胞瘤sknsh細胞中的表達及對細胞存活率的影響。方法 pcr擴增alpha突觸核蛋白基因，產(chǎn)物純化后與pcdna3.1(+)載體進行連接反應, 構建pcdna3.1(+)/alpha突觸核蛋白真核重組質(zhì)粒。lipofectamine法轉染人神經(jīng)母細胞瘤sknsh細胞，rtpcr方法檢測sknsh細胞中alpha突觸核蛋白mrna的表達，四甲基偶氮唑鹽(mtt)法檢測其對細胞存活率的影響。結果 酶切鑒定及基因測序證明人alpha突觸核蛋白基因已被完整、正確地插入到pcdna3.1(+)載體中。rtpcr 結果顯示該表達載體轉染sknsh細胞后，細胞內(nèi)alpha突觸核蛋白mrna的表達水平明顯增高，mtt方法檢測結果顯示該表達載體轉染并未引起細胞存活率的改變。結論 alpha突觸核蛋白真核重組質(zhì)粒構建成功, 并可在sknsh細胞內(nèi)表達，且對細胞的存活率不產(chǎn)生任何影響，從而為進一步研究alpha突觸核蛋白在帕金森病發(fā)病機制中的作用奠定了基礎。

【關鍵詞】  α突觸核蛋白;質(zhì)粒;帕金森病

construction of the eukaryotic expression plasmid of human alphasynuclein gene and its expression in sknsh cells he qing, du tingting, song ning, et al (department of physiology, shandong provincial key laboratory of pathogenesis and prevention of neurological disorders and state key disciplines: physiology, qingdao university medical college, qingdao 266071, china); [abstract] objective to construct the eukaryotic expression plasmid of human alphasynuclein gene and detect its expression in human sknsh neuroblastoma cells and its effect on cell viability. methods pcr was performed to amplify the entire fragment of human alphasynuclein gene, and the amplified gene was inserted into the eukaryotic expression vector pcdna3.1 (+) to form the new construct donated pcdna3.1(+)/alphasynuclein after purification. liposomemediated gene transfection method was used to transfect the human sknsh cells. rtpcr was used to detect the transient expression of alphasynuclein gene. mtt assay was used to detect the changes in cell viability. results recombinant contained the correct and entire nucleotide sequence of human alphasynuclein gene was found to be successfully constructed via restriction enzyme digestion and sequencing methods. levels of alphasynuclein mrna were obviously increased in sknsh cells with reconstructive plasmid transfection. however, no significant changes in cell viability were observed in these transfected cells. conclusion the eukaryotic expression plasmid of human alphasynuclein gene is successfully constructed and expressed in sknsh cells. the cell viability is not affected. all these results establish a foundation for a further study of the role of alphasynuclein in the pathogenesy of parkinson disease.

[key words] alphasynuclein; plasmids; parkinson disease

帕金森病(pd)是最常見的神經(jīng)退行性疾病，發(fā)病率僅次于老年癡呆。其主要的病理改變是黑質(zhì)致密帶多巴胺能神經(jīng)元脫失及伴發(fā)的紋狀體軸突末梢多巴胺的耗竭[1]。pd的發(fā)病機制目前還不清楚，可能與老齡、環(huán)境毒素、遺傳因素、氧化應激、興奮性毒素、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺失等因素有關[23]。近年來，蛋白質(zhì)的異常修飾和錯誤折疊在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病發(fā)病中的作用越來越受到關注，被認為可能是神經(jīng)細胞變性死亡的關鍵環(huán)節(jié)。alpha突觸核蛋白為一種在健康人的腦組織中廣泛分布的可溶性蛋白，被認為是pd發(fā)病機制中最重要的蛋白。alpha突觸核蛋白是路易小體的主要結構成分，其聚集與路易小體的形成及多巴胺能神經(jīng)元的死亡密切相關[4]。但是目前alpha突觸核蛋白為何發(fā)生聚集形成路易小體以及聚集過程中對多巴胺能神經(jīng)細胞的毒性作用還不十分清楚。因此，本實驗擬構建一種攜帶人alpha突觸核蛋白的真核重組質(zhì)粒，并轉染人神經(jīng)母細胞瘤sknsh細胞，為探討影響alpha突觸核蛋白聚集的因素以及alpha突觸核蛋白聚集的毒性作用機制提供基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗所需大腸桿菌菌株jm109和pcdna3.1(+)載體均為本實驗室保存。dmem培養(yǎng)基購自gibco公司，各種限制性內(nèi)切酶、dna連接酶購自中國寶生物工程(大連)有限公司。質(zhì)粒小提試劑盒購自貝基生化科技有限公司，膠回收試劑盒、pcr產(chǎn)物純化試劑盒和rt試劑盒購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司。瓊脂糖購自bioasia生物技術公司，lipofectamine 2000購自invitrogen公司。四甲基偶氮唑鹽(mtt)購自sigma公司。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。sknsh細胞購自上海中國科學院細胞庫。其他化學試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 alpha突觸核蛋白基因的pcr擴增

根據(jù)genbank中已收錄的alpha突觸核蛋白cdna序列設計特異引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。上游引物:5′ctcgagcggccgccagtgtgatg3′(xhoⅰ酶切位點)，下游引物:5′tctagaatctcaagaaactgggagcaaag3′(xbaⅰ酶切位點)。以sknsh細胞全長cdna為模版，pcr擴增alpha突觸核蛋白基因獲得所需片段。擴增片段大小為545 bp。pcr循環(huán)條件:94 ℃變性1 min，56 ℃復性1 min，72 ℃延伸2 min，共循環(huán)30次，最后72 ℃再延伸10 min。取2 μl擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳。

1.3 alpha突觸核蛋白真核表達載體pcdna3.1(+)/alpha突觸核蛋白的構建及鑒定

alpha突觸核蛋白的pcr產(chǎn)物經(jīng)20 g/l瓊脂糖凝膠電泳分離、回收純化。將pcdna3.1(+)空載體采用xbaⅰ和xhoⅰ酶切、回收純化后將目的基因(alpha突觸核蛋白)和載體(pcdna3.1(+))按3∶1的摩爾比混合，用t4 dna ligase 進行連接反應，16 ℃下16 h以上，連接后24 h內(nèi)將連接產(chǎn)物轉化入感受態(tài)大腸桿菌jm109中，挑取陽性單克隆，在含氨芐青霉素的l培養(yǎng)液中搖菌培養(yǎng)過夜，裂解大腸桿菌，提取、純化質(zhì)粒，用xbaⅰ和xhoⅰ雙酶切連接產(chǎn)物，并用10 g/l瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結果。將酶切鑒定正確的結果送交上海生工生物工程技術服務有限公司測序。將構建好的鑒定無誤的重組質(zhì)粒命名為pcdna3.1(+)/alpha突觸核蛋白。

1.4 細胞培養(yǎng)

sknsh細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)0.10胎牛血清、105 u/l青霉素和100 g/l鏈霉素的dmem培養(yǎng)液中，置于體積分數(shù)0.05的co2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，每2～3 d傳代一次。

1.5 細胞轉染

在轉染前1 d，將處于對數(shù)生長期的sknsh細胞按每孔106個細胞接種于6孔板中，使其在轉染之日達到80%的融合度，使用lipofectaminetm 2000 將pcdna3.1(+)/alpha突觸核蛋白真核重組轉染入細胞中(參照脂質(zhì)體轉染說明書)，每孔按照dna(μg)∶lipofectaminetm 2000=1∶5轉染5 h后，更換為含體積分數(shù)0.10胎牛血清的完全新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至48 h。同時，設立轉染pcdna3.1(+)的空載體對照組和不轉染的空白對照組。

1.6 rtpcr 檢測外源alpha突觸核蛋白基因在sknsh細胞中的表達

瞬時轉染48 h后，將alpha突觸核蛋白真核重組質(zhì)粒轉染組、pcdna3.1(+)的空載體對照組與不轉染的空白對照組細胞用trizol法提取總rna，進行rtpcr 反應，以檢測alpha突觸核蛋白在轉錄水平的表達情況。alpha突觸核蛋白檢測引物的上游序列為：5′caagtgacaaatgttggaggag3′，下游序列為：5′tttcttaggcttcaggttcgtag3′，擴增片段長度為244 bp;內(nèi)參照gapdh引物的上游序列為：5′ttcaccaccatggagaaggc3′，下游序列為5′ggcatggactgtggtcatga3′，擴增片段長度為236 bp。pcr 反應參數(shù)：94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)36次。

1.7 mtt法檢測細胞存活率

參照脂質(zhì)體轉染說明書，將處于對數(shù)生長期的sknsh細胞按每孔104個接種于96孔板中并同時轉染，置于37 ℃、體積分數(shù)0.05 co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 g/l的mtt 20 μl，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄上清后每孔加入二甲基亞砜100 μl，用酶標儀測定570 nm處吸光度(a)值。

1.8 統(tǒng)計學處理

采用spss 12.0軟件進行統(tǒng)計學處理，結果以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以p<0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

重組質(zhì)粒pcdna3.1(+)/alpha突觸核蛋白經(jīng)xbaⅰ和xhoⅰ雙酶切后，分別獲得長度為545 bp和5 422 bp的dna片段。見圖1。

2.2 alpha突觸核蛋白真核表達載體測序

alpha突觸核蛋白真核重組質(zhì)粒中alpha突觸核蛋白基因的測序結果進一步證實alpha突觸核蛋白克隆片段的插入方向正確，插入序列符合要求。測序發(fā)現(xiàn)克隆的alpha突觸核蛋白基因片段的編碼區(qū)序列和genbank中報道的序列完全一致。

2.3 外源alpha突觸核蛋白基因在sknsh細胞中的表達

pcdna3.1(+)/alpha突觸核蛋白轉染sknsh細胞48 h后，轉染組alpha突觸核蛋白mrna表達水平明顯增高。見圖2。

①dna標準參照物dl2000;②pcdna3.1(+)/alpha突觸核蛋白重組質(zhì)粒經(jīng)xbaⅰ和xhoⅰ雙酶切的片段;③dna標準參照物dl15000。

圖1 pcdna3.1(+)/alpha突觸核蛋白質(zhì)粒的雙酶切鑒定

①～③分別為正常細胞組、空載體轉染組、pcdna3.1(+)/alpha突觸核蛋白轉染組內(nèi)參照gapdh; ④為dna標準參照物dl2000;⑤～⑦分別為正常細胞組、空載體轉染組、pcdna3.1(+)/alpha突觸核蛋白轉染組alpha突觸核蛋白。

圖2 pcdna3.1(+)/alpha突觸核蛋白轉染sknsh細胞中alpha突觸核蛋白基因的表達

2.4 重組質(zhì)粒pcdna3.1(+)/alpha突觸核蛋白在sknsh細胞中表達后對細胞存活率的影響

正常細胞組、pcdna3.1(+)載體轉染組以及pcdna3.1(+)/alpha突觸核蛋白轉染組細胞存活率比較，差異無顯著性(f=0.005，p>0.05)。

3 討 論

在生理狀態(tài)下，alpha突觸核蛋白是一種天然未折疊的可溶性蛋白，但其構象極易受外界環(huán)境的影響。低ph值、高溫、有機溶劑、金屬離子、鹽溶液及殺蟲劑等條件下可形成前熔球、α螺旋、β折疊、二聚體、寡聚體以及不溶性的聚集體等狀態(tài)[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，家族性與散發(fā)性pd中均伴有alpha突觸核蛋白含量的增高，并出現(xiàn)alpha突觸核蛋白聚集形成的路易小體，說明了alpha突觸核蛋白與pd的發(fā)病密切相關[67]。目前已有一些對alpha突觸核蛋白高表達的細胞模型的研究，有研究者認為，很多細胞高表達alpha突觸核蛋白后會產(chǎn)生明顯的細胞毒性[8];但也有研究者認為，細胞內(nèi)高表達alpha突觸核蛋白后只有在一些誘導其聚集的因素如氧化應激條件下才會產(chǎn)生毒性[9]。這些研究結果差異反映了人們對alpha突觸核蛋白的致病機制仍不十分清楚。pd病人腦內(nèi)存在的氧化應激、炎癥反應、高鐵等狀態(tài)被認為是其發(fā)病重要原因[10]，這些因素是否與alpha突觸核蛋白聚集有關呢? 泛素蛋白酶體系統(tǒng)(ups)是細胞內(nèi)重要的非溶酶體蛋白降解途徑，它可以清除真核細胞中異常蛋白質(zhì)，維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。異常折疊的alpha突觸核蛋白也可通過此途徑被降解。但研究表明，與其他部位相比，黑質(zhì)中泛素酶活性降低33%～42%以及選擇性的蛋白酶體亞單位活性喪失[11]。在散發(fā)型pd的黑質(zhì)神經(jīng)元中的26/20s蛋白酶體的α亞單位和20s蛋白酶體酶的活性都有損失[12]。過表達突變的alpha突觸核蛋白亦可降低蛋白酶體的活性，降低細胞對蛋白酶體抑制劑的耐受性, 引起線粒體損害和細胞凋亡[13]。alpha突觸核蛋白在腦中由可溶性的單體變?yōu)椴豢扇艿木奂w很可能是pd的始發(fā)因素。

究竟是什么因素引起alpha突觸核蛋白的升高并出現(xiàn)聚集呢?alpha突觸核蛋白是通過何種途徑抑制ups的活性而引起自身的聚集呢?基于上述問題，本研究通過pcr法擴增真核細胞alpha突觸核蛋白序列，將pcr產(chǎn)物進行電泳分離，回收，純化，將該片段克隆入pcdna3.1(+)載體中，轉化，提取，純化質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定、基因測序正確后，命名為pcdna3.1(+)/alpha突觸核蛋白，將其轉染入sknsh細胞內(nèi)觀察到alpha突觸核蛋白的表達水平明顯升高，且對細胞存活率并無明顯的影響。

綜上所述，本研究成功地構建了alpha突觸核蛋白真核表達載體，并轉染至sknsh細胞， 通過rtpcr方法檢測其在sknsh細胞中的表達。本文結果為探討影響alpha突觸核蛋白聚集的因素以及alpha突觸核蛋白聚集的毒性作用機制提供了研究基礎。

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真核細胞范文第4篇

病歷資料

例1：患兒，女，8歲，以主因雙眼瞼水腫2天入院。體溫正常，無寒戰(zhàn)及抽搐。不流涕，無咳嗽、咳痰、氣喘。食納差，未見嘔吐、腹痛、腹脹、腹瀉。入院查體：乏力狀，雙眼瞼腫脹，顏面輕微浮腫，無皮疹，淺表淋巴結無腫大，無口唇皸裂、指趾末端硬性紅腫、脫屑。咽部充血明顯，扁桃體無腫大，無膿膜。心、肺、腹、脊柱、四肢、神經(jīng)系統(tǒng)無異常。輔助檢查：血常規(guī)：WBC 7.0×109/L、N 0.78、L 0.15、PLT 156×109/L。尿常規(guī)：未提示異常。入院診斷：①急性上呼吸道感染。②急性腎小球腎炎。給與利巴韋林抗病毒，營養(yǎng)支持治療，利尿，低鹽飲食。治療5天，雙眼瞼腫脹無明顯消退，出現(xiàn)發(fā)熱，咳嗽，頻繁劇烈，無痰，不喘。食納差，未見嘔吐、腹痛、腹脹、腹瀉。未述胸悶、心悸、頭痛、頭暈。查體：熱病容，乏力狀態(tài)，無皮疹，頸部淺表淋巴結約綠豆大小、可觸及3枚，質(zhì)軟，活動度好，無壓痛，無口唇皸裂，指趾末端硬性紅腫，脫屑。咽部充血明顯，扁桃體無腫大，未見散在膿膜。心、肺、腹、脊柱、四肢、神經(jīng)系統(tǒng)無異常。輔助檢查：血常規(guī)：WBC 2.8×109/L、N 0.18、L 0.85、PLT 256×109/L。異常白細胞檢查：異常淋巴細胞0.26。胸部正位片：雙肺紋理粗亂、模糊。心臟：未提示異常。腹部B超：巨脾，肝臟明顯增大。轉院檢查：EB病毒抗體：陽性。嗜異凝集反應：陽性。確診：傳單，臨床治療20余天，長期隨診3個月。預后良好。

例2：患兒，女，13歲，以主因間斷低熱、乏力6個月入院。熱程不規(guī)則，自述乏力時，測體溫37.3～37.5℃。查體：淺表淋巴結無明顯腫大，咽部輕微充血，扁桃體不大，呼吸音略粗，未聞及啰音，心腹、脊柱、四肢、神經(jīng)系統(tǒng)無異常。輔助檢查：血、尿、便常規(guī)無異常。ASO＼ESR＼CRP＼風濕＼類風濕因子＼支原體＼衣原體抗體＼PPD皮試，胸部正側位平片，心臟，腹部B超均正常。初步診斷：青春期綜合征。給予多種維生素，谷維素等調(diào)節(jié)治療1個月，無明顯緩解。轉院輔助檢查：EB病毒抗體：陽性。嗜異凝集反應：陽性。確診：傳單。臨床治療半月，隨診半年，預后良好。臨床誤診原因：⑴熱待查：兒童或青年多見于：①感染因素：細菌感染，支原體、衣原體感染，病毒感染，結核感染。②非感染因素：幼年性類風濕，川崎病，傳單，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，癌癥等。⑵傳染性單核細胞增多癥診斷依據(jù)不清楚。多數(shù)臨床醫(yī)生認為，發(fā)熱，皮疹，淋巴結腫大，肝脾腫大為必須具備條件。以至于每天查房，有無皮疹，肝脾是否腫大為查體及診斷重點。其實不然。

討 論

傳染性單核細胞增多癥簡稱傳單，是EB病毒感染所致的一種急性或亞急性淋巴細胞良性增生性傳染病，多見于兒童或青年。在集體機構中可造成流行。潛伏期30～50天。兒童潛伏期較短。前驅(qū)期癥狀隱匿，類似上呼吸道感染癥狀，持續(xù)1～2周。腺腫期主要表現(xiàn)淋巴結腫大，發(fā)熱，咽炎，肝脾腫大。所有患者均有淋巴結腫大，以頸部淋巴結腫大最為常見，不對稱，無粘連，無壓痛，大小不等。腫大的淋巴結在熱退后數(shù)周消退，偶見可持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年。85%有發(fā)熱，熱型不規(guī)則，一般持續(xù)1～4周。80%～85%有咽痛，扁桃體腫大，充血和厚霜樣滲出物。50%病例有脾腫大，少數(shù)可有巨脾。30%有肝腫大。少數(shù)病例有紅色斑丘疹、眼瞼水腫、肺炎、神經(jīng)系統(tǒng)損害，血小板減少、自身免疫性溶血性貧血。確診依據(jù)：①嗜異凝集反應：陽性。②EB病毒抗體：陽性。③骨髓涂片：原始淋巴細胞不增多。④外周淋巴細胞：增多。異常淋巴細胞≥10%。本文案例提示不明原因眼瞼腫脹，乏力，初期尿常規(guī)正常，雖然傳單眼瞼水腫發(fā)病率屬少數(shù)，但不排除傳單診斷。長期發(fā)熱：兒科患者發(fā)熱>1周圍即屬于熱待查，熱程>1個月，甚至半年，輔助檢查無明顯提示異常，患兒無進行性消瘦，衰竭癥狀，傳單診斷不排除。

真核細胞范文第5篇

【關鍵詞】 肺癌; 基因治療; 生存素; 啟動子; 單純皰疹病毒1型胸苷激酶

[Abstract] Objective: To construct a lung cancer specific the herpes simplex virus 1 thymidine kinase (HSV1TK) expression vector regulated by survivin promoter (SURV) and detect its activation and potential to inhibit the grow of lung cancer in vivo. Methods: Plasmid pGL3TK was obtained by substituting the luciferase cassette with a PCR product corresponding to TK with flanking Nco Ⅰ and Xho Ⅰ sites. To obtain the pSURVTK and pCMVTK two versions， the SURV and CMV cassettes were excised with Bgl Ⅱ and Hand Ⅲ and cloned into the respective sites of the vector. Recombinant plasmid pSURVTK and pCMVTK were transfected into survivin positive or negative cell lines by the means of lipofectamine. The expression of HSV1TK was tested by Western Blotting， Ganciclovir cytotoxicity assay to evaluate the activation of SURV and in vivo tumorigenesis experiments to explore the potential using this vector to treat lung cancer. Results: The vector pSURVTK has been successfully constructed which can not only express the TK protein indentified by Western Blotting， but also show its enzyme activation related to the concentration of ganciclovir and suppression of tumor growth in vivo. Conclusion: Survivin promoter can effectively drive the HSV1TK to express. The expression of TK gene will be confined just within the site of tumor. This presented a new way of employment sucide genes for treatment of lung cancer.

[Key words] lung cancer; gene therapy; survivin; promoter; herpes simplex virus 1 thymidine kinase

肺癌已成為惡性腫瘤死亡的首要病因，傳統(tǒng)的治療方法包括化療、放療和手術，總的生存率不到15 %[1]。隨著免疫學和分子生物學的飛速發(fā)展，肺癌的基因治療越來越受到研究人員的重視。采用非病毒載體攜帶治療基因，如自殺基因單純皰疹病毒1型胸苷激酶(HSV1TK)基因是目前肺癌基因治療的研究熱點之一。這些非病毒載體一般使用真核細胞啟動子如巨細胞病毒啟動子(CMV promoter)，該啟動子無組織特異性，在正常細胞中也能高表達TK基因，通過使無毒的前藥如更昔洛韋(GCV)轉化成有毒的磷酸化產(chǎn)物，對正常組織也會造成損傷[2，3]。所以，研究在肺癌細胞高表達，而在正常組織低表達，甚至不表達的特異性啟動子是肺癌自殺基因治療成功的關鍵。

生存素(survivin)是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins， IAP)家族的新成員，其組織分布特征具有明顯的細胞選擇性，在胚胎及多種腫瘤細胞系中高表達，但是不表達于終末分化的正常組織[4-6]。Survivin主要通過轉錄水平調(diào)控mRNA或蛋白的表達[7-8]。

本研究構建了生存素基因啟動子(survivin promoter)調(diào)控的HSV1TK基因表達載體，通過體內(nèi)外對肺癌細胞的殺傷效應研究，證實生存素啟動子在肺癌細胞異性活化，可以驅(qū)動其調(diào)控的下游TK基因的表達，在更昔洛韋(Ganciclovir，GCV)的作用下，可有效抑制肺癌細胞的生長，為應用自殺基因治療肺癌提供了新思路。

1 材料和方法

1.1 試劑和工具酶

異丙基β半乳糖苷(IPTG)、低分子質(zhì)量蛋白標準品、核酸標準參照物、限制性內(nèi)切酶Bgl Ⅱ、Hind Ⅲ、Nco Ⅰ、Xho Ⅰ和Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、質(zhì)粒DNA純化試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA標準參照物(上海華美生物工程公司);蛋白胨、酵母粉、丙烯酰胺等(上海生工生物工程公司);PCR引物均由上海英駿生物技術有限公司合成。脂質(zhì)體Lipofectamine2000 購于Invitrogen 公司，更昔洛韋購自羅氏公司，兔抗HSV1TK血清由耶魯大學William C Summers教授饋贈。

1.2 質(zhì)粒和細胞株、菌株

Survivin基因啟動子SURV由美國MD Anderson Cancer Center的MienChie Hung教授饋贈，含有HSV1TK cDNA的質(zhì)粒rpAs16Dr由德國MartinLuther大學Ariane Sling教授饋贈， pGL3Basic載體購自美國Promega公司，質(zhì)粒pcDNA3.1(+)、人肺癌細胞株A549、E.coli菌株XL1Blue由本室保存。

1.3 儀 器

凝膠掃描儀、蛋白電泳儀、電轉化儀、凝膠掃描儀、AKTA Prime 高壓液相色譜儀(以上均為伯樂公司產(chǎn)品)，恒流泵(蘭格公司)。

1.4 重組載體pSURVTK、pCMVTK，pSURVLuc、pCMVLuc的構建

根據(jù)HSV1TK的DNA序列設計一對引物，在P1和P2的5′ 端引Nco Ⅰ和Xho Ⅰ兩個酶切位點，TKP1：5′ATCCATGGATGGCTTCGTACCCCT3′和TKP2：5′ATCTCGAGTCAGTTAGCCTCCCCC3′，將PCR產(chǎn)物亞克隆至用Nco Ⅰ和Xho Ⅰ消化的真核表達質(zhì)粒pGL3Luc，PCR鑒定陽性重組質(zhì)粒pGL3TK;Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ酶切pcDNA3.1(+)并回收CMV啟動子，與SURV啟動子一起克隆至pGL3Luc和pGL3TK的Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ酶切位點間，Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定重組載體pSURVTK、pCMVTK，并經(jīng)DNA測序證實。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測轉染細胞外源HSV1TK基因表達蛋白

人肺癌細胞系A549及正常人肝細胞LO2均用DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。轉染前1天，取生長良好的細胞，胰酶消化，記數(shù)，將細胞濃度調(diào)至5×104個/ml，在6孔細胞培養(yǎng)板的每孔加入2 ml含上述細胞的DMEM培養(yǎng)液，每孔細胞數(shù)為1×105個。在Lipofectamine 2000的介導下分別轉染pSURVTK質(zhì)粒和pCMVTK質(zhì)粒。每種質(zhì)粒轉染3個孔，具體按Lipofectamine 2000操作手冊進行，待轉染的細胞用無血清、無雙抗的DMEM培養(yǎng)基洗2次，在每孔中加入混勻的DNA脂質(zhì)體復合物溶液，細胞在37 ℃繼續(xù)溫育5 h后，吸去轉染液，加入2 ml含10%小牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。PBS充分洗滌細胞，100 ℃、10 min將細胞裂解，取15 μl細胞裂解液加15 μl 2×加載緩沖液，100 ℃、10 min，12 000×g離心10 min。取20 μl上清12% SDSPAGE電泳，陰性對照為未轉染的A549、LO2細胞裂解物，電轉移至硝酸纖維膜，加1∶200稀釋的兔抗HSV1TK血清37 ℃輕搖孵育2 h，1×PBST(含0.05% Tween20)洗膜3次，加1∶200稀釋的羊抗兔IgGHRP， 37 ℃輕搖孵育2 h，加鄰苯二胺顯色10 min，水洗終止反應。

1.6 MTT法測定細胞增殖抑制率

在96孔細胞培養(yǎng)板的每孔中加入0.1 ml含上述細胞的DMEM培養(yǎng)液，每孔細胞數(shù)為5×104個，用pSURVTK，pSURVLuc質(zhì)粒DNA 在Lipofectamine 2000的介導下轉染細胞，質(zhì)粒的用量為0.1 μg/孔;脂質(zhì)體Lipofectamine 2000的用量為0.2 μl/孔。每種質(zhì)粒轉染40個孔。轉染48 h后，分別加入終濃度為0，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5，10，50，100，150 μmol/L的GCV，其中不加GCV的3孔作為對照組，以上每份樣品均設3個復孔。37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)3 d。采用MTT法測定細胞增殖情況。1000 r/min離心5 min，去上清，每孔加入MTT(5 mg/ml)10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入100 μl二甲亞砜(DMSO)混勻，570 nm測D值，根據(jù)下列公式計算細胞增殖抑制率(GIR)：GIR(%)=(1-實驗組光密度值/對照組光密度值)×100%。

1.7 pSURVTK抗腫瘤實驗

將A549細胞懸浮于PBS中，濃度調(diào)至1×107個/ml。BALB/c 裸鼠，雌雄不限，4～6周齡，體質(zhì)量30～60 g，隨機分為3組，每組10只。分別于背部皮下注射100 μl細胞。當腫瘤體積達到30 mm3時，瘤內(nèi)注射pSURVTK、pCMVTK、pCMVLuc 質(zhì)粒DNA-脂質(zhì)體復合物(50 μg/次)，每隔1天依次轉染，連續(xù)7次，轉染的第2次各組動物同時尾靜脈注射GCV，100 mg /kg，共6次。每隔1天測量1次腫瘤體積，腫瘤體積(V)=A(mm)×B(mm)2/2。A為腫瘤最長直徑，B為最短直徑。

1.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均采用x±s形式表示，利用SAS 8.1軟件對各實驗組的細胞增殖抑制率與其對照組的差異顯著性進行t檢驗分析。

2 結 果

2.1 真核表達載體pSURVTK、pCMVTK，pSURVLuc、pCMVLuc的構建

將制備好的TK基因PCR片段亞克隆至真核表達載體pGL3Luc中，篩得的陽性菌落經(jīng)PCR擴增鑒定，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見到與TK基因相對分子質(zhì)量一致的目的基因片段(HSVTK相對分子質(zhì)量為1144 bp左右)(圖1A)，核苷酸序列測定結果表明，克隆基因的核苷酸序列與HSVTK的DNA序列完全一致，說明pGL3TK構建成功;將制備好的SURV、CMV啟動子片段分別亞克隆至pGL3-Luc或pGL3TK真核表達載體Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ的酶切位點間，篩得的陽性菌落經(jīng)Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ雙酶切，獲得900 bp大小CMV啟動子基因(圖1B，泳道1)和977 bp大小SURV啟動子基因(圖1B，泳道2)，經(jīng)核苷酸序列測定證實，pSURVTK、pCMVTK，pSURVLuc、pCMVLuc構建成功。圖1 PCR擴增HSV1TK基因及pSURVTK、pCMVTK重組真核表達載體酶切鑒定

2.2 HSV1TK基因的表達

轉染pSURVTK質(zhì)?；騪CMVTK的質(zhì)粒A549細胞裂解蛋白能被兔抗HSV1TK陽性血清特異性識別，且識別條帶的濃度相近，而轉染pSURVLuc質(zhì)?；騪CMVLuc質(zhì)粒的A549細胞以及轉染pSURVTK transfected LO2細胞裂解蛋白則不能被識別(圖2)，說明HSV1TK基因在SURV啟動子調(diào)控下于肺癌細胞異性高效表達。

2.3 TK蛋白的酶活性

對轉染pSURVTK質(zhì)粒的A549細胞進行不同濃度(0.01～500 μmol/L)GCV的細胞毒實驗，采用MTT法檢測72 h時的細胞殺傷活性。A549細胞的生長呈明顯的濃度依賴性，低濃度(0.1 μmol/L)GCV對其的抑制率在第3天達到了41%，且抑制率與GCV濃度及作用時間(數(shù)據(jù)未列出)呈正相關，而轉染pSURVLuc質(zhì)粒的A549細胞在同樣濃度的GCV作用下生長幾乎未受影響(圖3)。t檢驗分析表明差異具統(tǒng)計學意義，由此表明SURV啟動子調(diào)控下的HSV1TK基因仍具有很好的酶活性。

M：蛋白標準參照物;1：轉染pSURVTK的A549 細胞;2：轉染pCMVTK的A549細胞;3：轉染pSURVLuc的 A549 細胞;4：轉染pCMVLuc的 A549細胞;5：轉染pSURVTK的LO2細胞圖2 SURV啟動子調(diào)控HSV1TK基因表達的蛋白印跡分析　圖3 HSV1TK基因表達對肺癌細胞和正常細胞增殖的影響

2.4 HSV1TK基因?qū)w內(nèi)腫瘤生長的抑制作用

第6天肺癌瘤體長至38 mm3大小，這時3組大鼠分別瘤內(nèi)注射pSURVTK、pCMVTK、pCMVLuc 質(zhì)粒DNA脂質(zhì)體復合物，接著尾靜脈應用GCV，20 d后pSURVTK組和pCMVTK組腫瘤大小僅分別為85、83 mm3，而pCMVLuc組(對照載體)大小為180 mm3，P

3 討 論

自殺基因療法的最大特征就是具有“旁觀者效應”，即只要正常組織有少量目的基因獲得表達，就有可能產(chǎn)生嚴重的副作用[9]。因此，使自殺基因僅在肺癌組織中獲得特異性表達，從而準確地殺傷腫箭頭處為給藥時間點， *：P

圖4 體內(nèi)轉染pSURVTK對腫瘤生長的抑制作用瘤細胞，保護正常組織，減少毒副作用，是肺癌采用自殺基因療法的關鍵。其中，用腫瘤特異性啟動子啟動目的基因特異性的表達是目前多數(shù)學者關注的方法之一[3]。

研究顯示，SURV啟動子在腫瘤細胞中具有高活性，正常細胞株和組織中被抑制，尤其是肺組織。SURV啟動子在心、肺、腦、肝、腎活性很低，表明當體內(nèi)應用SURV調(diào)控的TK基因載體時，毒副作用可以大大降低[10]。

常用的腫瘤特異性啟動子如AFP、hTERT等啟動子的活性往往弱于CMV啟動子和SV40啟動子，SURV啟動子也不例外。我們的研究結果顯示，雖然SURV在各種腫瘤細胞的活性僅為CMV啟動子的10%～40%，已足夠抑制腫瘤細胞的生長，一方面表明SVRV啟動子在肺癌細胞中也具有很強的啟動下游基因轉錄的活性，另外，特異性表達于肺癌細胞中的TK也產(chǎn)生顯著的旁觀者效應，極大地彌補了啟動子活性低的不足。

我們構建了SURV啟動子調(diào)控下的HSV1TK基因的真核表達載體pSURVTK，采用蛋白質(zhì)印跡法證實pSURVTK在肺癌細胞系A549中可表達出TK蛋白，GCV細胞毒實驗表明表達的TK蛋白具有酶活性，可有效抑制體內(nèi)肺癌的生長。

綜上所述，SURV啟動子可以驅(qū)動TK基因在肺癌細胞中的特異性轉錄，在GCV作用下，體內(nèi)外能有效殺傷肺癌的生長，為自殺基因治療肺癌提供了新的途徑。

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